陈 立，杜 娟，陈 丽，吕晓红

帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)是中老年人常见的神经系统变性疾病，主要病理变化是路易小体形成和黑质多巴胺能神经元丢失，目前的治疗只能通过多巴胺替代疗法改善其症状，并不能阻止病情的进展。神经干细胞的全能性和成体干细胞横向分化的多潜能性为帕金森的治疗提供了新的思路和方法。本实验利用神经营养因子GDNF 及dbcAMP 对神经干细胞进行单独及联合诱导，希望能获得足够数量的多巴胺能神经元，为定向诱导分化的神经元进一步应用于临床打下基础。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级孕14～16 d Wistar 大鼠由吉林大学动物中心提供。

1.2 试剂 培养基DMEM/F12、B27(Gibco)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)(Peprotech)，胎牛血清(FBS)(杭州四季青公司)，二丁酰环磷腺苷酸(dibutyryl adenosine 3’，5’cyclic monophosphate，dbcAMP)(Santa)，兔抗鼠神经元特异性中间丝(Neuron-specific intermediate filament，Nestin)、兔抗鼠5-溴脱氧尿苷(5-Bromodeoxyuridine，Brdu)、兔抗鼠络氨酸羟化酶(TH)多克隆抗体、山羊抗兔免疫组化试剂盒、异硫氰酸荧光素(FITC)标记山羊抗兔IgG(武汉博士德公司)。

1.3 神经干细胞的体外分离及原代培养 神经干细胞的体外分离与培养 取妊娠14～16 d 的Wistar 大鼠，给予乙醚吸入麻醉，无菌操作取出胚胎，置于冰浴的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)内，分离胚胎中的脑组织，小心剥离脑膜及血管，将取出的脑组织剪成小组织块，加入0.125% 胰蛋白酶消化30 min 左右，用含10% 胎牛血清终止消化，0.01%DNaseI 继续对脑组织消化30 min 左右，离心，将离心后的细胞悬浮于干细胞培养基中，培养基包含bFGF 20 ng/ml 和EGF 20 ng/ml 及DMEM/F12 培养基(另含2% B27，HEPES 10 mmol/L，谷氨酰胺2 mmol/L，青霉素100U/ml，链霉素100 U/ml)，调整细胞密度至5×105/ml，接种至25 ml 培养瓶。……