徐 洋，余旭平，沈锦玉，姚嘉赟，郝贵杰，潘晓艺，尹文林

（1.浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310020；2.浙江省淡水水产研究所，浙江湖州 313001）

罗非鱼无乳链球菌溶血素的产生条件及特性

徐 洋1，2，余旭平1*，沈锦玉2，姚嘉赟2，郝贵杰2，潘晓艺2，尹文林2

（1.浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310020；2.浙江省淡水水产研究所，浙江湖州 313001）

不同的培养条件影响罗非鱼无乳链球菌分离株L4产生β-溶血素的溶血价。最佳培养条件为将种子液按1∶20的比例接种于THB肉汤培养基中，28℃静置培养120h。该溶血素对热非常敏感，在-20℃保存较稳定，在4，28，37℃保存均易失活。人O型血红细胞对该溶血素最敏感，其次为小鼠和罗非鱼的红细胞，再次为黄颡鱼、鲫鱼、人的A、B、AB型血红细胞，草鱼红细胞对其最不敏感。

罗非鱼；无乳链球菌；溶血素；培养条件；特性

近几年来，中国几大罗非鱼主养区相继暴发罗非鱼链球菌病［1-7］，该病的传播途径多，且传染能力极强，对渔业生产造成巨大危害。作者从2009年海南某地患暴发性链球菌病的罗非鱼体分离鉴定一株罗非鱼无乳链球菌分离株L4［8］，该菌在绵羊血平板上产生β溶血现象，因此认定该菌能够产生β-溶血素。本试验就罗非鱼无乳链球菌溶血素产生的相关条件及其特性开展研究，旨在为今后开展罗非鱼无乳链球菌致病机理的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

罗非鱼无乳链球菌分离株L4系作者从2009年海南某地患暴发性链球菌病的罗非鱼体分离获得。

Todd-Hewitt肉汤培养基（THB）和萘啶酮酸购自青岛海博生物技术有限公司；多粘菌素E购自湖北建国医药有限公司；淀粉、葡萄糖、Tween-80、SDS购自湖州华生化工物资有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、小牛血清、琼脂购自上海普林斯顿生物科技发展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶血素的产生条件试验

于THB琼脂培养基上复苏罗非鱼无乳链球菌分离株L4，挑取单菌落接种于THB，28℃静置培养12h制成种子液。

培养温度试验。将上述种子液按1∶20的比例接种于THB中分别置于4，28，37，40℃静置培养120h，取样测溶血价。

培养基和培养时间试验。将种子液按1∶20的比例分别接种到THB、含6%小牛血清的THB和含25mg·mL-1BSA、3%Tween-80的THB中，28℃静置培养，分别于12，24，36，48，60，72，84，96，108，120，132，144h取样测溶血价。

培养环境试验。将种子液按1∶20接种THB，在28℃情况下，分别置于转速110r·min-1摇床和静置在细菌培养箱内培养120h，取样测溶血价。

1.2.2 溶血价的测定

将所取样品经6000r·min-1离心15min，上清液用PBS倍比稀释，再加入等体积1%的人O型血红细胞悬液，37℃静置1h，3000r·min-1离心10min，记录溶血情况，同时用PBS和1%的SDS分别加入等体积的1%的人O型血细胞悬液作阴性和阳性对照，以50%红细胞溶解的最高稀释度为溶血价［9-10］。

1.2.3 溶血素的特性试验

溶血谱试验。选取罗非鱼、黄颡鱼、鲫鱼、草鱼、小鼠和人的红细胞制备1%的血红细胞悬液，进行溶血价的测定。

活性保存试验。将种子液按最佳培养条件培养后，12000r·min-1离心5min，取上清液。将上清液分别保存于-20，4，28，37℃，分别于24，48，72h测定溶血价。

热敏感试验。将种子液按最佳培养条件培养后，12000r·min-1离心5min，取上清液。将上清液分别在37℃孵育1h，在56℃孵育30min，在100℃孵育1min，测定溶血价。

2 结果与分析

2.1 培养产生溶血素的条件

2.1.1 温度

图1表明，温度对溶血素的溶血价有较大影响，28℃时溶血价最高，达64。

图1 温度对溶血素产量的影响

2.1.2 培养基和时间

表1表明，不同的培养基和培养时间对溶血素的溶血价有显著影响，在24h内3种培养基中均未测到溶血素，溶血素溶血价最高的是在THB中培养120h；在含6%小牛血清的THB中，溶血素从60h开始出现溶血价为4，到132h到达顶峰溶血价为16；在含25mg·mL-1BSA和3%Tween-80的THB中，溶血素从48h开始出现溶血价为4，到120h达到最高峰溶血价为32。

表1 培养基和培养时间对溶血素溶血价的影响

2.1.3 环境

置于28℃110r·min-1摇床培养48h，测得溶血价仅为16；而在28℃细菌培养箱内静置48h，测得溶血价为64。

2.2 溶血素的特性

2.2.1 溶血谱

溶血素能溶解多种动物的红细胞，其中人O型血红细胞对其最敏感，溶血价可达64；其次为小鼠和罗非鱼的红细胞，溶血价为32；再次为黄颡鱼、鲫鱼、人的A、B、AB型血红细胞，溶血价为16；而草鱼红细胞对其最不敏感，溶血价仅为8。

2.2.2 保存活性

表2表明，溶血素在-20℃保存较稳定，在4，28，37℃保存均易失活，24h内丢失绝大部分活性，但随后活性丢失速度显著变慢。

2.2.3 热敏感性

溶血素对热非常敏感。37℃处理1h，溶血价从64下降至16；56℃处理30min，溶血价从64下降至4；100℃处理1min，溶血价从64下降至0。

表2 保存温度和时间对溶血素活性的影响

3 小结和讨论

罗非鱼无乳链球菌病已成为困扰罗非鱼养殖业发展的瓶颈，如何有效地防治此病，成为亟待解决的问题。开展毒力因子研究，明确致病机理将有助于解决这一问题。

目前对鱼源无乳链球菌毒力因子的研究主要集中在荚膜多糖、CAMP因子等［11-15］，未见溶血素研究的相关报道。因此鱼源无乳链球菌是否存在该外毒素有待进一步验证。作者的研究结果表明鱼源无乳链球菌能产生β-溶血素，同时作者就溶血素的最佳产生条件及特性开展了相关研究，明确了该外毒素的最佳产生条件，为今后成功复制该毒素提供保障。

该溶血素的溶血谱检测结果显示，人O型血红细胞对其最敏感，其次为小鼠和罗非鱼的红细胞，再次为黄颡鱼、鲫鱼、人的A、B、AB型血红细胞，草鱼红细胞对其最不敏感。说明人O型血红细胞与人的A、B、AB型血红细胞存在显著的差异，敏感性相差4倍；且人O型血红细胞的敏感性高于小鼠和罗非鱼的红细胞。通过人工感染试验已明确该分离株对小鼠和罗非鱼均具有较强致病力［8］，该分离株可能为人畜共患病原［16-17］。至于人血红细胞不同型之间的敏感性差异有待研究。

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（责任编辑：张才德）

S91文献标志码：A文章编号：0528-9017（2014）07-1096-03

文献著录格式：徐洋，余旭平，沈锦玉，等.罗非鱼无乳链球菌溶血素的产生条件及特性［J］.浙江农业科学，2014（7）：1096-1098.

2014-05-15

湖州市科技攻关计划项目（2010GG02）

徐 洋（1985-），女，浙江永康人，助理研究员，从事鱼类病害防治工作。E-mail：fionxu@foxmail.com。

余旭平。E-mail：xpyu@zju.edu.cn。