王桂平，张彦焘，刘新艳，潘学兵，周 琼，郭俐麟

（1.广州医科大学卫生职业技术学院药学系，广东广州510180；2.广州医科大学药物研究中心，广东广州510182）

·实验研究·

苯扎贝特协同顺铂抑制肺腺癌细胞生长和诱导凋亡

王桂平1，张彦焘1，刘新艳2，潘学兵1，周 琼1，郭俐麟1

（1.广州医科大学卫生职业技术学院药学系，广东广州510180；2.广州医科大学药物研究中心，广东广州510182）

目的观察过氧化物酶体增殖因子激活受体α（PPARα）激动剂苯扎贝特联用顺铂对肺腺癌A549细胞增殖抑制和诱导凋亡的协同效应及可能机制。方法采用CCK8法测定不同浓度苯扎贝特处理A549细胞的生长曲线，观察苯扎贝特、顺铂及两药联用对A549细胞的生长抑制作用，并应用中效原理评价两药联用效应；采用流式细胞技术分析苯扎贝特与顺铂联用对细胞凋亡的诱导作用，并通过qRT－PCR检测A549细胞中VEGF和HIF－1α mRNA的表达变化。结果苯扎贝特联合顺铂呈现明显协同抑制效应，两药联用时IC50值为15.92μmol·L－1，当苯扎贝特浓度小于588μmol·L－1，顺铂浓度小于206μmol·L－1，CI值小于1，即两药合用均产生协同作用。联合用药组细胞凋亡率明显高于单药组（P＜0.05），并且联合用药组较单药组显著下调VEGF和HIF－1αmRNA的表达，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论苯扎贝特联合顺铂对肺癌细胞具有协同抑制效应，并可有效诱导细胞凋亡，其机制可能与下调VEGF和HIF－1α的表达有关。

苯扎贝特；顺铂；肺腺癌；协同效应；过氧化物酶体增殖物激活受体

肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，居恶性肿瘤第一位。非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）是最常见的肺癌病理类型，占80%以上，而肺腺癌则是最常见的NSCLC之一［1］。单一药物化疗用药剂量较大、副作用较多且疗效不甚理想，因此，联合化疗是恶性肿瘤治疗的重要方法。含铂二药联合化疗是NSCLC的一线化学治疗方案，特别是第三代化疗药物如长春瑞宾、吉西他滨等可与铂类药物产生较为理想的联用效果［2，3］，然而，这些一线联用疗效已达平台期，因此，探索新的含铂类药物联合化疗方案，对进一步提高NSCLC的治疗效果，有着重要意义。

过氧化物酶体增殖因子激活受体（peroxisome proliferators activated receptors，PPARs）是一类与肿瘤和多种代谢性疾病密切相关的配体依赖活化的核转录因子。PPARs有3种亚型，即PPARα、PPARβ和PPARγ，具有调节脂质代谢、影响细胞增殖和分化等多种生物学功能［4］。PPARα是第一个被鉴别出来的PPAR亚型，研究发现其与乳腺癌、肝癌、子宫内膜癌和胰腺癌等多种肿瘤关系密切，而PPARα激动剂则可抑制多种肿瘤细胞的生长，因此，PPARα有可能成为一种新的肿瘤治疗靶点［5～7］。本研究主要研究PPARα受体激动剂苯扎贝特与顺铂联合，观察其对肺癌A549细胞的增殖抑制和凋亡诱导效应，以期为肺癌的临床治疗探索出一种新的治疗思路。

1 材料与试剂

苯扎贝特（Bezafibrate）和顺铂（Cisplatin，DDP）均购自Sigma公司，RPMI1640培养基（Gibico公司），胎牛血清（FBS，杭州四季青生物），qRT－PCR System（广州莱德尔生物科技有限公司）和CCK8试剂盒（碧云天生物技术有限公司）。Sunrise酶标仪（瑞士Tecan公司），XDS－1B倒置相差显微镜（重庆光电仪器有限公司）及Forma 3111型二氧化碳培养箱（美国Thermo Scientific公司）。肺腺癌细胞株A549由广州医科大学实验中心提供。

2 方法

2.1 A549肺腺癌细胞培养 人肺腺癌细胞A549细胞培养于含10%胎牛血清、双抗（青霉素100 U·mL－1、链霉素100 U·mL－1）的RPMI1640培养基中，置37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。细胞贴壁生长，以0.25%的胰蛋白酶消化传代，约3 d传代1次。

2.2 A549细胞生长曲线 采用CCK8试剂盒测定A549细胞生长曲线。将A549细胞以5×103／孔的密度接种96孔板，实验设对照组和药物组，药物组分别加不同浓度的药物，对照组则加入等量培养基，每个浓度平行接种3孔。分别在接种1、2、3、4、5 d和6 d后，加入10μL CCK8混合液，继续培养3 h后去除上清，在酶标仪上读取OD值（波长为450 nm），以时间为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制生长曲线。

2.3 苯扎贝特联用顺铂对肺腺癌细胞增殖抑制作用 细胞增殖抑制实验采用CCK8试剂盒，具体操作按说明书进行。收集对数生长期A549细胞，按5 ×105·L－1密度接种于96孔培养板，每孔200μL。实验设苯扎贝特组、顺铂组、顺铂＋苯扎贝特组及对照组。药物处理48 h后，各孔加入CCK8混合液10 μL，37℃孵育3 h，在酶标仪450 nm波长测定其OD值，实验重复3次，取3次结果的平均OD值，进行统计学处理。计算细胞抑制率［抑制率%＝（1－A处理组／A对照组）×100%］。以细胞抑制率对不同药物浓度的对数作图，绘出抑制曲线，用CalcuSyn 2.0软件（Biosoft，USA）计算半数抑制浓度（IC50）。采用中效原理评价药物联合应用效应［8］。

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡［9］取对数生长期的人肺腺癌A549细胞，按1×106·mL－1以2 mL体积接种于6孔板内，置37℃，5%CO2培养箱培养12 h。实验组加入以培养基RPMI1640配制的不同浓度的药物，对照组加入等体积的培养基，培养48 h后终止培养。细胞经0.25%胰蛋白酶消化后，离心管收集细胞悬液，然后加入70%冰乙醇5 mL混匀固定，4℃放置24 h以上。然后加入无RNA酶的碘化丙啶（PI）染色，室温避光15 min，300目滤网过滤后，进行流式细胞检测，实验重复3次。

2.5 荧光定量PCR 检测A549细胞VEGF和HIF－1αmRNA表达药物干预24 h后，采用RNeasy Mini Kit抽提样品中总RNA，并对所提取的RNA进行纯度检测及总RNA完整性检测等质量评估。每个20μL的PCR反应，加入50 ng总RNA，特异引物和TaqMan引物终浓度分别为300 nmol·L－1和200 nmol·L－1，与12.5μL TaqMan Universal qPCR MasterMix混合进行PCR扩增；PCR参数为：95℃变性5 min，然后40循环：95℃（15 s），60℃（15 s）及72℃（30 s）。以18S rRNA作内参对照，荧光信号由ABIPrism 7300 Sequence Detection System（Applied Biosystems）检测。靶基因及内参引物如下：HIF－1α：5－GTGGATTACCACAGCTGA－3（forward），5－GCTCAGTTAACTTGATCCA－3（reverse）；VEGF：TGTCTAATGCCCTGGAGCCT（forward），GCTTGTCACATCTGCAAGTACG（reverse）；18S＃rRNA：5－CCTGGATACCGCAGCTAGGA－3（for-ward），５－GCGGCGCAATACGAATGCCCC－3（reverse）。

2.6 统计方法 数据分析采用SPSS 17.0统计软件。数据以均数±标准差（±s）表示，多组资料之间的比较采用单因素方差分析（One－Way ANOVA），方差分析显著时，采用LSD（least significant difference）或SNK（student neuman keuls）法进行各组均数间的多重比较，以P＜0.05为有统计学意义。

3 结果

3.1 细胞生长曲线 采用CCK8法测定肺腺癌A549细胞及不同浓度苯扎贝特处理A549细胞的生长曲线，实验结果如图1所示。正常状态下，A549细胞12 d生长较缓慢，2～4 d为快速增殖期，随后细胞增殖变缓慢。苯扎贝特对A549有抑制作用，并且随着苯扎贝特剂量增大，其抑制率也增高；200 μmol·L－1或400μmol·L－1的苯扎贝特可对A549产生明显的抑制作用。

图1 CCK8法测定A549细胞生长曲线

3.2 中效浓度及合用指数的计算 本研究应用中效原理对苯扎贝特与顺铂联用的作用进行评价。依据顺铂和苯扎贝特的IC50而确定苯扎贝特与顺铂联合用药比例为2.85∶1。应用剂量－效应分析软件（CalcuSyn 2.0），计算出苯扎贝特、顺铂单用及合用时斜率（m）、中效浓度（Dm）及相关系数（r），结果见表1。依据中效原理，计算出苯扎贝特和顺铂联合应用时的合用指数combination index（CI）与作用效应（fa）的关系，具体见图2，当bezafibrate浓度小于588μmol·L－1，顺铂浓度小于206μmol·L－1，CI值小于1，即两者合用产生协同作用。

3.3 苯扎贝特与顺铂联合应用对细胞凋亡的影响

细胞凋亡实验结果见表2，与对照组相比，苯扎贝特组（200μmol·L－1）、顺铂组（100μmol·L－1）及两药联用组的早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率均有统计学差异（P＜0.05），特别是当两药联用时，细胞凋亡率统计学差异显著（P＜0.001）。

表1 苯扎贝特、顺铂单用及合用时斜率（m）、中效浓度（Dm）及相关系数（r）

图2 苯扎贝特与顺铂合用时的效应与合用指数的关系

表2 苯扎贝特与顺铂联合应用对A549细胞凋亡的影响（s，n＝3）

表2 苯扎贝特与顺铂联合应用对A549细胞凋亡的影响（s，n＝3）

注：与阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.001；与苯扎贝特组或顺铂组比较，＃P＜0.05，＄P＜0.001

组别 早期凋亡率（%）晚期凋亡率（%）总凋亡率（%）4.08±0.07 7.37±0.94 11.45±1.10苯扎贝特（200μmol·L－1） 7.23±0.74* 22.68±1.01** 29.91±1.55**顺铂（100μmol·L－1） 6.02±0.66* 25.51±1.49** 31.53±1.80**苯扎贝特＋顺铂 13.70±1.56**＃37.67±2.08**＃ 51.37±3.65**＄对照组

3.4 苯扎贝特与顺铂联合应用下调VEGF和HIF－1αmRNA表达 本研究采用qRT－PCR检测苯扎贝特、顺铂或是两药联用对VEGF和HIF－1α mRNA表达影响，实验结果见图3。100μmol·L－1苯扎贝特或100μmol·L－1顺铂均可下调VEGF和HIF－1αmRNA表达，特别是两药联用组下调VEGF和HIF－1αmRNA表达的效果较100μmol·L－1苯扎贝特或100μmol·L－1顺铂组明显（P＜0.05）。

4 讨论

近年来，PPARα激动剂的抗肿瘤作用逐渐受到关注，该类制剂可抑制结肠癌、白血病、黑色素瘤及乳腺癌等肿瘤细胞生长［5～7］，提示PPARα受体激动剂可能成为一种高效低毒的抗肿瘤药物。本研究主要探讨PPARα受体激动剂苯扎贝特和顺铂联合应用对肺腺癌A549细胞的增殖抑制效应，从而为临床寻找新的化疗增敏剂提供理论和实验依据。在本研究中，我们发现苯扎贝特和顺铂联合可产生良好协同抑制A549细胞的效应，而且合用时中效浓度及各自所需用量均比单用时要小（见表1）。顺铂单用时Dm为69.63μmol·L－1，合用时Dm为4.2 μmol·L－1，合用时比单用时小16.5倍；而苯扎贝特单用时Dm为147.8μmol·L－1，合用时Dm为11.8μmol·L－1，合用时比单用时小12.5倍。这说明联合用药各药只需较少的剂量即可产生较好的抗肿瘤效果，可减少和避免了顺铂单独应用的毒性反应。同时，从苯扎贝特与顺铂合用的效应与合用指数关系（见图2）中可以看出，随着两药剂量的增加，其效应fa和CI也相应增加，当效应fa＞0.9时，两药合用指数CI＞1，产生拮抗效应；fa＜0.9时，CI＜1，两药合用可产生协同作用，即当按苯扎贝特＜588 μmol·L－1与顺铂＜206μmol·L－1的剂量联合用药时，可产生协同作用。近期，王绩英等［10］报道非诺贝特与顺铂或三氧化二砷联用可以增强细胞增殖抑制作用；而Murray等［11］也报道苯扎贝特与甲孕酮联用可产生协同抗急性白血病作用。上述数据说明，贝特类药物可增加顺铂或其他抗肿瘤药物的抗癌作用。然而，不同比例苯扎贝特与顺铂的联合用药会对联合效应产生什么样的影响，苯扎贝特与顺铂以什么比例联合可达最好效应？此外，两药合用时给药时间先后次序不同，对合用效应是否有影响？这些问题仍需进一步的研究。

图3 苯扎贝特（BEZ）、顺铂（DDP）及两药联用对A549细胞VEGF（A）和HIF－1α（B）mRNA表达的影响

目前，PPARα受体激动剂抗肿瘤机制尚不清楚，认为可能与调控细胞周期、抑制炎症反应、抗血管生成及诱导细胞凋亡等有关［5～7］。HIF－1α和VEGF与许多肿瘤发生和转移关系密切，特别是在肺癌的发生、侵袭及转移过程扮演重要角色，例如HIF－1α异常表达与肺癌的组织分期和细胞分型等过程密切相关，而VEGF异常表达可作为肺癌的早期诊断和淋巴结转移的一项重要指标，并且HIF－1α和VEGF已成为肺癌治疗的重要靶位［12，13］。本研究观察到苯扎贝特或与顺铂的联用均可有效诱导A549细胞凋亡，并且通过qRT－PCR发现苯扎贝特下调HIF－1α和VEGF基因的表达，提示苯扎贝特抑制A549细胞增殖和诱导凋亡可能与下调HIF－1α和VEGF基因的表达有关，此与其他学者的发现相一致。例如Yokoyama等［14］报道PPARα受体激动剂氯贝酸可通过下调VEGF的表达从而抑卵巢癌的生长；Parums等［12］发现非诺贝特也可以通过抑制肿瘤细胞分泌VEGF和FGF等机制抑制肿瘤血管的生成。Zhou等［15］报道PPARα受体激动剂可下调乳腺癌（MCF－7）和卵巢癌（A2780）细胞中HIF－1α的表达，抑制HIF－1α信号传导通路和VEGF的产生，从而发挥抗肿瘤效应。由上述数据推测，HIF－1α和VEGF可能是PPARα受体信号传导通路中的重要分子，苯扎贝特等PPARα受体激动剂可能是通过活化PPARα受体，使HIF－1α和VEGF等分子表达下调，从而发挥抗肿瘤效应。然而，有研究表明在人的血管内皮细胞中非诺贝特可通过PPARα非依赖性的方式发挥作用，苯扎贝特是通过“依赖PPARα方式”，还是“非依赖PPARα方式”下调肺癌细胞中HIF－1α和VEGF的表达，此仍需要进一步研究。

［1］杨玲，李连弟，陈育德，等.中国肺癌死亡趋势分析及发病、死亡的估计与预测［J］.中国肺癌杂志，2005，8（4）：274－278.

［2］Kim HJ，Kim TG，Lee HJ，et al.A phase II study of combination chemotherapy with docetaxel and carboplatin for elderly patientswith advanced non－small cell lung cancer［J］.Lung Cancer，2010，68（2）：248－252

［3］Goss GD，Arnold A，Shepherd FA，et al.Randomized，double－blind trial of carboplatin and paclitaxel with ei-ther daily oral cediranib or placebo in advanced nonsmall－cell lung cancer：NCIC clinical trials group BR24 study［J］.JClin Oncol，2010，28（1）：49－55.

［4］Schoonjans K，Staels B，Auwerx J.The peroxisome proliferator activated receptors（PPARS）and their effects on lipid metabolism and adipocyte differentiation［J］.Biochem Biophys Acta，1996，1302（2）：93－109.

［5］Maggiora M，Bologna M，CerùMP，et al.An overview of the effectof linoleic and conjugated－linoleic acids on the growth of several human tumor cell lines［J］.Int JCancer，2004，112（6）：909－919.

［6］Saidi SA，Holland CM，Charnock－Jones DS，et al.In vitro and in vivo effects of the PPAR－alpha agonists fenofibrate and retinoic acid in endometrial cancer［J］.Mol Cancer，2006，5：13.

［7］Thuillier P，Anchiraico GJ，Nickel KP，et al.Activators of peroxisome proliferator－activated receptor－αpartially inhibit mouse skin tumor promotion［J］.Mol Carcinog，2000，29（3）：134－142.

［8］Xu SP，Sun GP，Shen YX，et al.Synergistic effect of combining paeonol and cisplatin on apoptotic induction of human hepatoma cell lines［J］.Acta Pharmacol Sin，2007，28（6）：869－878.

［9］Wang G，Ye Y，Yang X，et al.Expression－based in silico screening of candidate therapeutic compounds for lung adenocarcinoma［J］.PLoSOne，2011，6（1）：e14573.

［10］王绩英，王涛，曾锦荣，等.非诺贝特联用顺铂对人肺癌A549细胞抑制和凋亡的实验研究［J］.山东医药，2011，51（48）：10－13.

［11］Murray JA，Khanim FL，Hayden RE，et al.Combined bezafibrate and medroxyprogesterone acetate have efficacy without haematological toxicity in elderly and relapsed acute myeloid leukaemia（AML）［J］.Br J Haematol，2010，149（1）：65－69.

［12］Parums DV.Current status of targeted therapy in nonsmall celllung cancer［J］.Drugs Today（Barc），2014，50（7）：503－525

［13］Ren W，Mi D，Yang K，et al.The expression of hypoxiainducible factor－1αand its clinical significance inlung cancer：a systematic review and meta－analysis［J］.Swiss Med Wkly，2013，143：w13855.

［14］Yokoyama Y，Xin B，Shigeto T，etal.Clofibric acid，a peroxisome proliferator－activated receptor alpha ligand，inhibits growth of human ovarian cancer［J］.Mol Cancer T-her，2007，6（4）：1379－1386.

［15］Zhou J，Zhang S，Xue J，et al.Activation of peroxisome proliferator－activated receptorα（PPARα）suppresses hypoxia－inducible factor－1α（HIF－1α）signaling in cancer cells［J］.J Biol Chem，2012，287（42）：35161－35169.

Inhibition effects of bezafibrate in coordination w ith cisp latin on cell grow th and inducing apoptosis of lung adenocarcinoma cells

WANG Gui-ping1，ZHANG Yan-tao1，LIU Xin-yan2，PAN Xue-bing1，ZHOU Qiong1，GUO Li-lin1
（1.Department of Pharmacy，Health Collegy，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510180，China；2.Drug Research Center，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510182，China）

ObjectiveTo observe the effects of peroxisome proliferator－activated receptorα（PPARα）agonistbezafibrate combinated with cisplatin（DDP）on proliferation and apoptosis of lung adenocarcinoma（AC）A549 cell and the possiblemechanism.MethodsCCK8 kit assay was used to detect growth inhibiton curve of A549 cells treated with various concentrations of bezafibrate.Themedian－effectmethod was used to evaluate the combination effect.Cell apoptosiswas evaluated with flow cytometry，and the expression of VEGF and HIF－1αmRNA were analyzed using real－time PCR（qRT－PCR）.ResultsBezafibrate combinated with DDP showed significately synergy inhibition effect，and the IC50was 15.92 μmol·L－1when the two agentswere combined.The combination index（CI）was less than 1 when the concentration of bezafibrate＜588μmol·L－1and cisplatin＜206μmol·L－1，namely two drugs combination showed synergy effect.The cell apoptosis rate of A549 cellswas significately higher than single drug group（P＜0.05）.The expression level of VEGF and HIF－1αmRNA were significately lower in combination group than in bezafibrate or cisplatin group（P＜0.05）.ConclusionOur results demonstrated that bezafibrate combinated with cisplatin showed synergy inhibition effect on lung AC，which may be related with the down－expression of VEGF and HIF－1α.

Bezafibrate；Cisplatin；Lung adenocarcinoma；Synergy effect；PPAR

R979.1

A

2095－5375（2014）11－0621－005

广东省自然科学基金项目（No.S2011010004147）；广州医科大学2011年科研基金博士启动基金（No.2011C06）

王桂平，男，博士研究生，研究方向：抗肿瘤药物筛选及机制研究，E－mail：docgpwang＠163.com