胡 骑，何于雯，信爱国，李华春

(云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒重点实验室，云南昆明 650224)

口蹄疫(Food and mouth disease，FMD)是由小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)的FMD 病毒(FMDV)引起的偶蹄动物传染病。FMDV 存在7 种相互无交叉保护性免疫应答的不同血清型(O、A、C、SAT-1、SAT-2、SAT-3 和Asia1)[1-2]。FMDV 能够在BHK-21、IB-RS-2、羔羊或牛睾丸细胞等多种细胞上复制。通常采用观察FMDV 细胞病变效应(CPE)和测定病毒组织半数感染量(TCID50)的方法来分析FMDV 的复制效率。随着具有快速、敏感、特异性强的实时定量RT-PCR(qRT-PCR)技术在FMDV 基因表达水平的分析、病原体的定性和定量检测等方面得到了广泛的应用[3-6]，通过建立qRT-PCR 方法分析FMDV 在细胞培养物中的复制动态，测定FMDV 即时增殖滴度，明确病毒的复制效率，是对上述传统方法的有益补充。

本实验针对FMDV 3D 基因，建立检测FMDV的SYBR Green I qRT-PCR 方法，以BHK-21 细胞18S rRNA 为内参基因，采用双标准曲线法[7]分析FMDV 感染细胞总RNA 中FMDV 基因组当量(Genome equivalents per μg total RNA，GE/μg)，应用该方法对亚洲1 型FMDV 兔化弱毒ZB(att)株和其体外拯救病毒vZB 株感染BHK-21 细胞后的病毒复制动态进行了测定，同时测定病毒一步生长曲线，进行比较分析。该方法为FMDV 的检测和研究FMDV 增殖规律及致病性等相关研究提供了一种快速评价方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株和细胞系 FMDV 亚洲1 型兔化弱毒ZB 株细胞适应毒ZB(att)(DQ533483)、ZB(att)株感染性克隆pZBatt 体外拯救病毒vZB[8]以及用于FMDV qRT-PCR 特异性验证的蓝舌病病毒(BTV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖障碍综合征病毒(PPRSV)由云南省畜牧兽医科学院保存。BHK-21 传代细胞系由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所于力研究员惠赠。

1.2 主要试剂 病毒总RNA 提取试剂TRIpure Reagent 购自北京艾德莱生物科技有限公司；……