高峰,蔡琴,蔡伦,卢芙蓉

(1.华中科技大学同济医学院附属协和医院内分泌科,武汉 430022;2.武汉市中心医院神经外科,武汉430014;3.华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科,武汉 430022)

·特约稿·

4-羟基异亮氨酸的研究现状*

高峰1,蔡琴1,蔡伦2,卢芙蓉3

(1.华中科技大学同济医学院附属协和医院内分泌科,武汉 430022;2.武汉市中心医院神经外科,武汉430014;3.华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科,武汉 430022)

4-羟基异亮氨酸是从葫芦巴种子中提取的活性成分,其药理作用较为广泛,主要包括降血糖、降血脂、改善胰岛素抵抗等,因而作为传统中药成分被用于治疗2型糖尿病、血脂异常、代谢综合征以及脂肪肝等疾病。该文就4-羟基异亮氨酸的研究现状及应用前景进行综述。

4-羟基异亮氨酸;胰岛素分泌;胰岛素抵抗;血脂紊乱

随着社会经济发展和生活方式的改变,我国疾病谱也发生显著变化,一些慢性非传染性疾病,例如高血压、动脉粥样硬化、冠心病、糖尿病、血脂异常、肥胖症的患病率正逐渐上升[1]。同时针对治疗这些疾病的药物也成为近年研究热点,尤其是传统中药成分。葫芦巴是草本植物,很久以前就已被当作调味品、蔬菜、治疗药物来使用[2]。作为古老的传统中药,葫芦巴的药理作用非常广泛,除了熟知的降血糖、降血脂活性,兼有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、减轻体质量、治疗脂肪肝和慢性肾衰竭等作用[3-4]。1973年,FOWDEN等[5]首次从葫芦巴中分离提取出其活性成分,一种非蛋白氨基酸即4-羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine,4-HIL),随后BROCA等[6]报道4-HIL包括两种非对映异构体,主要成分(2S,3R,4S)-异构体约占90%,次要成分构型为(2R,3R,4S)-异构体。笔者主要就4-HIL的提取分离、合成、药理作用以及临床应用前景进行相关探讨。

1 4-HIL的提取及分离

1973年,FOWDEN运用一系列方法从14 kg葫芦巴种子中分离得到(2S,3R,4S)-4-HIL 7 g。首先, 20%乙醇处理葫芦巴种子,重复提取3次;随后, Zeokarb225柱以及氨水分离洗脱,产物真空浓缩;浓缩部分进一步应用Dowex50×8柱和氨水分离洗脱;浓缩结晶后将其盐酸化,90℃加热10 min后再次利用Dowex50柱和水持续洗脱,最终收获(2S,3R,4S)-4-HIL[5]。

1984年,SAUVAIR等采用不同的方法从葫芦巴种子中也提取到4-HIL。该小组首先将葫芦巴种子磨成粉末状,再用70%乙醇提取6次后真空浓缩;随后利用Amberlite IR 120 H+型以及氨水分离洗脱氨基酸混合物;产物冷冻干燥后用硅60柱洗脱及分离;最后经纯化结晶得到4-HIL[7]。

以上两种提取分离4-HIL的途径,后者比前者提取率稍高,但总的来说,过程较为复杂,效率都很低。因此,近年来学者们更关注的是4-HIL的合成。

2 4-HIL的合成

2002年,WANG等[8]发明八步化学-酶合成法合成4-HIL。该方法首先以2-甲基乙酰乙酸乙酯为原料,在地霉菌的作用下得到(2S,3S)-3-羟基-2-甲基丁酸乙酯,再经过7个步骤转变成(2S,3R,4S)-4-HIL。其中,最关键的步骤为第一步,即(2S,3S)-3-羟基-2-甲基丁酸乙酯的生成。

2004年,FULCRAND等[9]提出六步化学-酶合成法合成4-HIL。第一步以溴乙酸叔丁酯为底物,在二苄胺的催化下得到二-N-苯甲基甘氨酸叔丁酯,经过开环、色层分析等分离得到外消旋4-HIL内酯,最后在青霉素酰基转移酶作用下水解N-苯乙酰内酯衍生物得到(2S,3R,4S)-4-HIL。

2007年,简化的体外两步合成4-HIL途径由SMIRNOV等[10]报道。该方法分为两个步骤,第一步为醛缩反应,乙醛和α-酮丁酸由特殊的醛缩酶(4-hydroxy-3-methyl-2-keto-pentanoate aldolase,HPAL)催化,形成4-羟基-3-甲基-2-酮戊酸盐(4-hydroxy-3-methyl-2-keto-pentanoate,HMKP);第二步是4-羟基-3-甲基-2-酮戊酸盐和L-谷氨酸盐在支链氨基酸转氨酶作用下氨基化形成(2S,3R,4S)-4-HIL。

2009年,KODERA等[11]为了追求更有效率的4-HIL合成方法,认为最有效的方法是最大程度地发挥L-异亮氨酸羟基化活性,而具有这种酶活性的只有L-异亮氨酸双加氧酶(L-isoleusine dioxygenase,IDO),于是首次提出利用苏云金芽孢杆菌菌株2e2在对数生长期产生IDO将L-异亮氨酸转变为(2S,3R,4S)-4-HIL,从而提高4-HIL的产率。作者希望该方法对工业化大量生产4-HIL提供有效途径。

2010年,SMIRNOV总结4-HIL合成方法的历史发展过程,再次提出关于合成4-HIL全新的思路。他提出利用大肠埃希菌产生IDO,继而在IDO催化下以L-亮氨酸和α-酮戊酸盐为原料产生4-HIL和琥珀酸盐,首次将4-HIL的生成与三羧酸循环联系起来。

纵观4-HIL合成方法的发展过程,值得一提的是合成法越来越简化,而4-HIL的产率越来越高,这样低成本、高效率的生产4-HIL更值得期待。

3 4-HIL的药理作用

3.1 促进胰岛素分泌作用 1999年BROCA等[12]首次报道4-HIL具有促胰岛素分泌作用。实验由以下几个部分构成:对Wistar大鼠行静脉注射葡萄糖耐量实验(intravenous glucose tolerance test,IVGTT),输注葡萄糖0.5 g·kg-1的同时加或不加4-HIL,实验前后不同时间点监测胰岛素和血糖水平;对正常狗行口服葡萄糖耐量实验(oral glucose tolerance test,OGTT),实验前给予或不给予胃内输注4-HIL(18 mg·kg-1),实验前后不同时间点监测胰岛素和血糖水平;糖尿病模型大鼠以50 mg·kg-1的剂量给予4-HIL连续治疗6 d后检测血糖及胰岛素水平;用4-HIL 200 μmol·L-1灌注不同浓度葡萄糖孵育的糖尿病模型鼠游离胰岛,并监测胰岛素水平。通过以上实验,结果显示4-HIL可直接作用于胰岛β细胞促进胰岛素分泌,血糖越高(8.3～16.7 mmol·L-1)作用越强。2000年,该小组进一步研究4-HIL的几种异构体及其内酯对胰岛素分泌的影响,他们用不同的制剂灌注体外胰腺(血糖为8.3 mmol·L-1),结果证实在浓度相同(200 μmol·L-1)的情况下(2S,3R,4S)-4-HIL促胰岛素分泌作用最强,其余两种异构体几乎无作用[13]。

3.2 改善胰岛素抵抗 胰岛素抵抗包括中枢性胰岛素抵抗和外周组织胰岛素抵抗,目前研究较多的是4-HIL对外周组织胰岛素抵抗的影响以及机制。2004年,BROCA等[14]首次报道4-HIL不仅能促进胰岛素分泌,而且具有改善胰岛素抵抗的作用。该小组利用金标准实验方法正葡萄糖高胰岛素钳夹实验,检测高糖高脂饮食的斯泼累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠和Zucker fa/fa鼠的相关指标,结果显示4-HIL通过激活IRS-1相关的PI3K通路促进周围组织对葡萄糖的摄取利用,并减少肝脏葡萄糖输出以改善外周性胰岛素抵抗。

2005年,RUBY等[15]设计一项活体实验,该研究观察男性骑车者运动后4-HIL对肌肉糖原含量的影响。在该实验设计中,受试者禁食12 h,骑车90 min耗尽肌糖原后行股外侧肌活检,活检完及2 h后按体质量给予口服右旋葡萄糖或者口服含4-HIL的右旋葡萄糖;骑车后4 h内检测肌糖原含量。结果显示4-HIL可促进肌糖原的合成。2012年,JAISWAL用4-HIL作用于大鼠骨骼肌细胞(L6-Glut4myc),结果提示细胞肌小管对2-脱氧-[3H]-葡萄糖的摄取率明显升高,Glut4以及Glut1总表达量无明显变化,但向细胞膜转移的Glut4增多了;另外,4-HIL显著增加磷酸化AKT(Ser-473)的表达量。两项研究均证实4-HIL具有改善肌肉组织胰岛素抵抗的作用。

本小组的前期实验研究4-HIL对小鼠3T3-L1脂肪细胞和HepG2细胞肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)转化酶(TACE)-基质金属蛋白酶组织抑制因子-3(tissue inhibitor of metalloproteinases-3, TIMP-3)-TNF-α系统的影响。研究发现,4-HIL通过抑制TACE,增强TIMP-3表达来减少TNF-α的生成,进而抑制IRS-1(Ser307)的磷酸化,促进Glut4的表达[16]。因此,笔者认为4-HIL可改善肝脏以及脂肪组织的胰岛素抵抗。

3.3 调脂作用 1990年,SHARMA等[17]首次报道葫芦巴种子的降血脂作用。随后,一项动物实验证实葫芦巴种子的活性成分4-HIL也保留降血脂作用。该研究利用高脂饮食建立血脂异常的仓鼠模型,口服4-HIL 50 mg·kg-1,治疗持续1周。结果显示三酰甘油(triglycerides,TG)下降33%,总胆固醇(total cholesterol,TC)下降22%,甘油和游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)浓度下降,但高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)升高[18]。

2010年,SINGH小组给予具有2型糖尿病典型特征的C57BL/KsJ-db/db小鼠灌胃4-HIL 50 mg·kg-1·d-1,连续治疗10 d,实验期间检测血糖、血浆胰岛素、TG、TC、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、HDL-C。结果显示血糖、血浆胰岛素、TG、TC、LDL-C显著降低,HDL-C升高[19]。

2012年,HAERI等[20]研究4-HIL对1型糖尿病(T1DM)模型鼠的血糖和血脂的影响。该实验通过注射链脲霉素建立T1DM模型,建模后给予4-HIL 50 mg·kg-1·d-1连续干预4周。4周后,血糖、TG、LDL-C、TC、尿酸下降,而HDL-C升高。

4 4-HIL的临床应用前景

4-HIL与西药成分的显著区别在于,中药成分的副作用少。众所周知,目前治疗糖尿病的一线药物都是西药,但其副作用有低血糖、体质量增加、消化道反应、肝肾损害等。倘若将4-HIL应用于临床治疗糖尿病、血脂异常、代谢综合征,在达到同样的治疗目标情况下,其治疗后的副作用将会明显减少或减轻,甚至忽略不计,故值得进一步的开发、研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.10.001

Research Update on 4-Hydroxyisoleucine

GAO Feng1,CAI Qin1,CAI Lun2,LU Fu-rong3
(1.Department of Endocrinology,Union Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430022,China;2.Department of Neurosurgery, Wuhan Central Hospital,Wuhan 430014,China;3.Department of Integrated Chinese Traditional and Western Medicine,Union Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430022,China)

Objective4-Hydroxyisoleucine(4-HIL)is the active component isolated from the seeds of Trigonella foenum-graecum.It exerts broad pharmacological effects such as anti-hyperglycemia,blood lipid lowing,improvement of insulin resistance,etc.As the Chinese traditional medicine,it can be used clinically in treating many diseases such as type 2 diabetes mellitus,dyslipidemia,metabolic syndrome,fatty liver and other diseases.Here the current research status and application prospect on 4-Hydroxyisoleucine were summarized.

4-Hydroxyisoleucine;Insulin secretion;Insulin resistance;Dyslipidemia

R284.2;R977.15

A

1004-0781(2014)10-1261-04

2014-04-20

2014-06-15

*国家自然科学基金资助项目(81001670)

高峰(1962-),男,湖北武汉人,教授,主任医师,博士,主要从事糖尿病基础与临床的研究。电话:027-85726799,E-mail:gaofengwh@aliyun.com。

卢芙蓉(1979-),女,湖北武汉人,主治医师,讲师,博士,主要从事糖尿病中西医结合基础与临床研究。电话: 027-85873071,E-mail:furonglulove@163.com。