王国田，张洋洋，王志敏(综述),李前文,杜云翔※(审校)

(1.蚌埠医学院研究生部,安徽 蚌埠 233000; 2.南京军区第八二医院肿瘤中心,江苏 淮安 223001)

肿瘤的浸润和转移是恶性肿瘤生物学特征之一，是导致治疗方案失败、预后不良、乃至患者死亡的重要因素,有关恶性肿瘤的浸润和转移一直是肿瘤研究的热点和难点。上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程,有利于肿瘤转移。我国是食管癌的高发区之一，其病死率在恶性肿瘤死因顺位中高居第4位，占恶性肿瘤死亡数的11.19%[1]。食管癌起病隐匿，大部分患者就诊时多已发生局部浸润和远处转移。因此为改善食管癌的治疗效果，对于EMT与食管癌侵袭转移的相关性研究逐渐成为肿瘤研究的焦点。

1 EMT相关蛋白与食管癌

1.1上皮钙黏素 上皮钙黏素是一个相对分子质量为120×103依赖Ca2+的细胞间跨膜糖蛋白，上皮钙黏素与连环素蛋白(α、β和γ)结合，再连接到细胞骨架上，以维持细胞间的稳定性和细胞的黏附极性。在食管癌中能观察到上皮钙黏素减少时肿瘤侵袭能力增加[2]，肿瘤转移能力增强[3]。钙黏素表达水平显著低于癌旁组织和正常食管组织，并且在不同浸润深度、有无淋巴结转移、TNM分期及肿瘤分化程度不同的食管癌组织钙黏素蛋白表达具有明显差异。在OE33食管腺癌细胞株中，上皮钙黏素表达沉默与食管腺癌进展密切相关[4]。

1.2波形蛋白 在EMT发生过程中，除了有上皮钙黏素表达缺失，还伴有其他蛋白的生成。如在EMT发生后，波形蛋白表达增加，波形蛋白与上皮钙黏素表达呈负相关[5-6]，波形蛋白是正常细胞和肿瘤间质细胞之间的中间纤维的主要蛋白成分，经常用来作为间充质病变的鉴别诊断，现在认为波形蛋白是EMT的标志物。波形蛋白主要表达于肿瘤细胞质，细胞表现梭形、多角形的形态，波形蛋白表达与远处转移密切相关，包括远处淋巴结转移，是淋巴结远处转移的一个独立预测指标[7]。

1.3神经钙黏素 神经钙黏素是钙黏素家族成员之一，相对分子质量为127×103，早期的研究表明，神经钙黏素在神经系统发育中起重要作用，现在越来越多的研究证实，神经钙黏素的高表达与恶性肿瘤的浸润转移密切相关[8-9]。食管鳞癌组织中神经钙黏素的高表达与食管鳞癌的浸润、恶化有密切的关系。RNA干扰(RNA interference,RNAi)沉默神经钙黏素基因表达能够使EC9706体外侵袭能力降低[10]。激活素A是转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)家族成员之一，在胚胎干细胞分化方面发挥了重大作用。激活素A诱导神经钙黏素的表达与肿瘤侵袭和预后差有关[9]。

2 EMT相关转录调节因子与食管癌

2.1Twist转录因子 Twist是一个保守的碱性螺旋-环-螺旋转录因子，已被明确作为上皮钙黏素的抑制因子，能诱导EMT的发生。人类Twist基因位于染色体7q21.2处，含有2个外显子和1个内含子。人Twist蛋白分子包含202个氨基酸，由N端、碱性螺旋-环-螺旋、C端三个区域组成[11]。Twist作用于上皮钙黏素上游合成过程，能识别上皮钙黏素启动子上的E-box序列，抑制上皮钙黏素的转录表达促进EMT，使肿瘤细胞容易脱离原发灶向周围组织侵袭，促进细胞的增殖，而抑制细胞的凋亡。Twist可以促进血管内皮生长因子的合成，从而促进恶性肿瘤的发生。这些特性决定着Twist基因与恶性肿瘤发生、发展关系密切。转录因子Twist在食管鳞癌高表达，并且与预后差、远处转移和5年生存率低密切相关[12-14]。高表达的Twist肿瘤组织有更多的淋巴结转移、远处转移、更高的分期和淋巴结浸润，且Twist高表达和上皮钙黏素减少有重要联系，两者呈负相关。Twist高表达和上皮钙黏素缺失时，患者生存率也会降低。因此，Twist也可以作为判断预后效果的标记和分子靶标。

2.2snail转录因子家族 snail转录因子家族包括snail(snail1)、slug(snail2)和无明显特征的Smuc(snail3)，人类snail基因位于染色体20q13.13处。所有这些snail家族成员在结构上具有相似性，包括含有4～6个锌指结构的高度保守的C端和一个高度可变的N端。Snail可与靶基因上含有的CAG-GTG核心碱基序列的E-box作用元件结合，从而调节其表达[15]。snail最初在果蝇体内发现，在胚胎发育中起重要作用，以后的研究也发现，snail和slug同Smad相互作用蛋白1(Smad-interacting protein-1，SIP-1)可竞争结合E-box序列，抑制上皮钙黏素的表达和波形蛋白表达水平的上升。Snail通过直接抑制钙黏素表达而诱导EMT，snail高表达更容易发生淋巴结转移、血道转移，与肿瘤分期密切相关[16-17]。slug是一个新的被认为是抑制上皮钙黏素表达的转录因子，上皮钙黏素表达与slug呈负相关，上皮钙黏素表达减少或slug表达阳性更容易发生淋巴结转移、浸润更深，预后更差[18]，提示slug是一个与转移高度相关的因子。Uchikido等[18]报道，slug在食管鳞癌高表达且与肿瘤侵袭、淋巴结转移和远处转移密切相关。slug在腺癌高表达，与上皮钙黏素低表达显著相关，在OE33细胞中slug过表达，抑制了上皮钙黏素的表达，诱导了间质型标志物波形蛋白和纤维连接蛋白的表达[4]，提示slug在食管癌的转移中发挥了重要的作用。

2.3ZEB家族转录因子 锌指结构转录因子中的E盒结合锌指蛋白(zinc finger E-box-binding protein，ZEB)是胚胎发育中的重要的转录因子。ZEB家族转录因子属于锌指蛋白类，包括ZEB1(δEF1)和ZEB2(SIP1)，ZEB1(δEF1)和ZEB2(SIP1)直接结合于受调节区域中的5′-CACCT序列，抑制钙黏素的转录，诱导细胞发生EMT。ZEB家族能促进EMT的发生，它是钙黏素的主要调节因子，在EMT发生过程中能够下调钙黏素的表达。最近研究表明，ZEB家族受微RNA的调节，ZEB家族水平与微RNA-200家族成员水平呈负相关，Notch蛋白的表达上调ZEB家族，下调微RNA-200，促进了细胞的增殖，抑制细胞向特定方向分化，Notch3是抑制ZEB家族表达的关键因素[19]。微RNA-205也可以调节ZEB1和ZEB2，抑制上皮钙黏素的表达，而促进EMT的发生[20]。

3 EMT相关微RNA与食管癌

微RNA是一类内源性、高保守、大小为20～25个核苷酸的单链非编码小分子RNA，在转录后水平调控基因的表达功能。一些微RNA位于肿瘤相关的脆性位点，而且微RNA在肿瘤组织中的表达水平与正常组织有明显的差异，所以说，微RNA可能参与了肿瘤形成中生理和病理过程[21]。微RNA也参与对EMT的调控，在肿瘤浸润转移中发挥重要作用。利用微RNA靶基因预测算法(靶基因预测软件)，ZEB家族被预测包括微RNA-200家族大量结合位点，而且两个微RNA-205结合位点已明确。微RNA-205通过调节ZEB2的表达而诱导EMT。食管细胞株微RNA-205表达水平较其他恶性肿瘤细胞株及正常食管上皮细胞明显增高，微RNA-205可以促使食管癌发生EMT，可能参与食管癌浸润及转移的发生机制[22]。

4 EMT相关生长因子与食管癌

EMT的发生是由肿瘤细胞之间以及肿瘤细胞与其细胞间质之间的复杂的相互作用诱导的，包括基质和细胞外成分，如通过自分泌和旁分泌产生的细胞因子和生长因子。EMT相关生长因子包括表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、TGF-β家族、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors,FGFs)、胰岛素样生长因子家族等。

4.1TGF-β 转化生长因子家族包括激活素、抑制素、骨形态发生蛋白、苗勒管抑制物等。TGF-β主要包括三个亚型：TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，其中TGF-β1是一种在调节细胞增殖、侵袭和凋亡具有双重作用的细胞因子。TGF-β有三种高亲和性受体：TGF-Ⅰ、TGF-Ⅱ和TGF-Ⅲ。TGF-Ⅲ随TGF-β结合到两种单跨膜丝氨酸/苏氨酸受体，主要为Ⅰ型[人活化素受体样激酶1(activin receptor-like kinase-1,ALK1),ALK2,ALK5]和Ⅱ型转化生长因子受体，形成包括两个Ⅰ型和Ⅱ型受体的异四聚体。活化的Ⅰ型受体可以磷酸化其下游信号分子Smad-2与Smad-3，进而与Smad-4形成三聚体复合物，进入细胞核，与smad结合元件结合后诱导靶基因的转录。参与TGF-β的信号网络，除了smad依赖通路，还有非smad依赖通路，如磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B通路、丝裂原活化蛋白激酶通路、Rho-GTP酶通路等[23]。TGF-β具有双重作用，既能抑制肿瘤的生长，又能诱导EMT促使肿瘤发生远处转移。

在食管癌中，TGF-β被认为是诱导EMT的重要因子，是目前研究最广泛的EMT诱导因子。TGF-β1诱导食管鳞癌细胞株EC9706发生EMT，将化学合成的TGF-β1的反义寡核苷酸(TGF-β1-Antisens Oligo Deoxy Nucleotides,TGF-β1-ASODN)转染食管鳞癌细胞株EC9706，TGF-β1可导致食管鳞状细胞癌上皮性标志物表达上调，间质性标志物波形蛋白表达下调，形态发生改变以及细胞的移动能力降低，沉默TGF-β1可抑制食管鳞癌细胞株的EMT[24-25]。体内实验表证明，TGF-β诱导的小鼠乳腺上皮细胞，其上皮标志物上皮钙黏素、紧密连接蛋白1、桥粒蛋白Ⅰ/Ⅱ表达下降，同时间质标记纤维连接蛋白表达下降[26]。采用免疫组织化学技术检测100例食管鳞癌手术切除标本中的TGF-β1、钙黏素、波形蛋白的表达，TGF-β1蛋白在食管鳞癌组织中的表达显著高于正常黏膜，其在深层浸润组织中的表达高于浅层浸润组织[27]。

有研究表明，胰岛素生长因子结合蛋白3能促进TGF-β诱导的EMT，也促进了Smad2和Smad3的磷酸化[28]。但是，TGF-β诱导的EMT也能被骨形成蛋白7和Smad4 RNAi逆转[29]。转染TGF-β1-ASODN可特异性地抑制食管鳞癌细胞EC9706中TGF-β1表达。

4.2EGF EGF通过与表皮生长因子受体结合诱导EMT。表皮生长因子受体在食管癌中表达，能促进EMT亚群细胞富集，并且与预后不良、化疗抵抗等密切相关[30]。在EC109细胞中，maspin蛋白(一种抑制肿瘤的丝氨酸蛋白酶抑制剂，它在抑制肿瘤生长和转移中发挥一定作用)抑制EGF诱导的EMT，改变了细胞的生长特性。一些具有选择性EGF的酪氨酸酶抑制剂(如厄洛替尼、人类单克隆抗体西妥昔单抗等)已在临床治疗中显示出良好的疗效[31]。EGF诱导的EMT在肿瘤转移中也发挥重要作用。有研究表明，EGF通过激活Janus蛋白酪氨酸激酶/信号转导和转录活化因子3(Janus protein tyrosine kinse/signal transducers and activators of transcription 3,JAK/STAT3)信号通路而诱导EMT[31]。STAT蛋白是转录因子家族成员，这些多功能蛋白磷酸化激活后，可调节下游靶基因的转录，STAT3基因是该家族现已被公认的癌基因，持续活化的STAT3可调控下游多个与肿瘤细胞增殖、分化、凋亡及浸润转移有关的靶基因的转录，从而在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。信号蛋白STAT3可能参与了食管鳞癌的EMT过程，并与食管鳞癌的侵袭转移相关[6]。

4.3HGF HGF是间质型细胞的活性因子，可促进有丝分裂、细胞运动等，HGF是一个已知的能促进内皮细胞生长、存活和侵袭的血管生长因子。HGF及其受体c-Met在肿瘤侵袭和发展中发挥重要作用。有研究发现，食管癌患者血清中HGF的水平明显高于对照组健康人，提示HGF的水平可能与肿瘤的发生、发展有密切联系，HGF在血清中的表达水平可以作为评价预后的一个独立指标[32]。HGF能够刺激食管鳞状细胞表达血管内皮细胞生长因子和白细胞介素8，从而增加细胞的侵袭和迁移能力[32]。

4.4FGFs 目前已发现有9种FGFs，分别为酸性FGF(FGF-1)，碱性FGF(FGF-2)，Int-2(FGF-3),FGF-4，FGF-5，FGF-6，角质细胞生长因子(FGF-7)，雄激素诱导性生长因子(FGF-8)和神经胶质激活因子(FGF-9)。FGFs是促进生长、抗凋亡、能够编码肝素结合蛋白相关基因家族成员之一，能够以自分泌和旁分泌的方式导致肿瘤的产生。目前有研究发现，食管癌中b-FGF的阳性表达率明显高于对照组(食管炎组织),并且b-FGF的表达与食管癌的浸润深度、淋巴结转移情况及临床分期显著相关[33]。提示b-FGF可能在食管癌的发生、发展中起关键作用，作为食管癌治疗中的一个新靶点对治疗及预后有较好理论价值。

4.5胰岛素样生长因子家族 胰岛素样生长因子1是胰岛素样生长因子家族的成员,是由70个氨基酸组成的多肽。绝大部分的胰岛素样生长因子1与特异性胰岛素样生长因子结合蛋白3以结合形式存在。胰岛素样生长因子1促进肿瘤细胞分裂增殖,促进细胞向恶性表型转化,并抑制肿瘤细胞的凋亡，从而参与了肿瘤的发生和发展。有研究报道，食管癌患者血清中胰岛素样生长因子1的水平明显高于健康人，提示胰岛素样生长因子1的水平可能与肿瘤的发生、发展有关[34]。胰岛素样生长因子1可刺激肿瘤细胞生长、抑制凋亡，胰岛素生长因子结合蛋白3则抑制胰岛素样生长因子1的生物活性[34]。另有研究表明，胰岛素生长因子结合蛋白3能促进TGF-β诱导的EMT发生，也促进了Smad2和Smad3的磷酸化[28]。

5 结 语

肿瘤细胞的侵袭和转移是肿瘤预后不良和导致死亡的主要原因，EMT是肿瘤侵润转移中的重要事件，在食管癌的侵袭转移中发挥了重要作用，与患者的预后密切相关。目前对于EMT与食管癌的研究正不断深入，其在食管癌侵袭转移中的作用不断被发现，探讨EMT的发生机制及相关性可以为以后食管癌临床治疗提供新的路径和靶点。

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