黄德旺 陆爱英 磨庆福 李军 谢宁 陈康部 蔡永林

·短篇论著·

梧州区域乙型肝炎病毒基因型分布及耐药基因自然变异调查

黄德旺1陆爱英2磨庆福1李军2谢宁1陈康部1蔡永林2

目的了解梧州区域乙型肝炎病毒（HBV）基因型、未经抗病毒治疗的耐药基因自然变异分布情况及两者与临床、免疫生化之间的关系。方法收集122例未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者血清，采用时间分辨荧光分析法检测乙肝病毒标志物，荧光定量PCR法检测HBV-DNA，PCR-反向点杂交法检测HBV基因型及变异基因。罗氏Cobas 702型全自动生化分析仪速率法检测转氨酶。结果122例乙型肝炎患者中，检出HBV-B型41例（33.6%），C型75例（61.5%），B+C混合型5例（4.1%），未分型1例（0.8%），未发现D型患者。共发现14例患者存在拉米夫定耐药基因自然变异，自然变异率为11.5%（14/122），其中C型14.7%（11/ 75）明显高于B型2.4%（1/41）（P<0.05）。B型和C型基因型分布的男女比例、年龄及HBV-DNA载量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。C型的血清谷丙转氨酶及谷草转氨酶水平、HBeAg阳性率显著高于B型（P<0.05）。结论梧州区域慢性乙型肝炎患者中，优势基因型为C型。在未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者中存在自然耐药变异基因，且C型较B型发生率高，C型可能与损害较严重的肝病有关。

乙肝病毒；基因型；耐药基因；自然变异

乙型肝炎病毒（HBV）基因型及耐药基因检测是目前国内外研究的热点，对指导临床用药、疗效评估、判断预后具有重要意义。HBV据全基因序列差异可分为A-H 8个基因型，基因型分布具有地域性，且存在自然耐药基因[1-2]。本研究就梧州区域乙肝病毒基因型从分布情况、是否存在耐药基因自然变异及与某些免疫生化指标是否存在相关性作一探讨。

资料和方法

一、研究对象

2012年9月至2013年9月本院住院及门诊慢性乙型病毒性肝炎患者122例，来自梧州区域户籍，均符合慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）诊断标准[3]。排除合并HIV、HAV、HCV、HDV、HEV感染，及酒精性、药物性、自身免疫性肝炎等所致的肝损害。所有病例检查前均无使用抗病毒药物治疗史，其中男92例，女30例，年龄18～72岁，平均年龄38.2岁。

二、HBV血清标志物检测

乙型肝炎e抗原（HBeAg）、乙型肝炎e抗体（HBeAb）检测采用时间分辨荧光分析法，试剂盒由苏州新波生物技术有限公司提供，仪器为ANYTEST时间分辨免疫分析仪。

三、HBV-DNA定量检测

采用荧光定量PCR法检测，试剂由中山大学达安基因公司提供，仪器为DA7600型实时荧光定量PCR仪。HBVDNA大于1 000 IU/mL为入选对象。

四、HBV基因分型和耐药突变基因检测

采用PCR-反向点杂交法检测HBV-B、C、D三种常见基因亚型及与拉米夫定、阿德福韦酯耐药相关的6个常见位点的突变：rt180M、rt204V、rt204I、rt207I为拉米夫定常见耐药位点，阿德福韦酯常见耐药位点为rtA181V、rtA236T。试剂由深圳亚能生物技术公司提供，仪器为ABI Veriti梯度PCR扩增仪、FYY-3分子杂交仪。

五、肝功能检测

谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）采用速率法检测。试剂由罗氏公司提供，仪器为罗氏Cobas 702型全自动生化分析仪。

六、统计学处理

采用SPSS 13.0软件，HBV-DNA载量经过对数转换后，以表示，组间比较采用成组设计t检验；ALT、AST结果以中位值（四分位数范围）表示，组间比较采用Mann-Whitney U秩和检验；率的比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、HBV基因型分布状况及HBV基因型与HBVDNA、HBeAg以及ALT、AST水平的关系

122例乙型肝炎患者中，检出HBV-B型41例（33.6%），C型75例（61.5%），B+C混合型5例（4.1%），未分型1例（0.8%），未发现D型患者。同时测定各基因型HBV-DNA、HBeAg以及ALT、AST水平。如表1所示。

B+C混合型和未分型患者例数过少，因此未纳入统计分析。B型和C型的男女比例比较，差异无统计学意义（χ2= 0.013，P=0.911）。两组的年龄及HBV-DNA载量比较，差异无统计学意义（t=1.411，0.041；P=0.161，0.683）。B型的血清ALT及AST水平显著低于C型（z=2.169，2.088；P= 0.030，0.037）。B型的HBeAg阳性率显著低于C型（χ2= 3.998，P=0.046），HBeAb阳性率则显著高于C型（χ2= 4.414，P=0.036）。

表1 122例不同HBV基因型患者临床资料与血清资料比较

二、耐药基因自然分布情况

如表2所示，本组病例中共发现14例患者存在拉米夫定耐药基因自然变异，自然变异率为11.5%（14/122）；但未发现阿德福韦酯耐药基因自然变异。其中C型患者的拉米夫定耐药基因自然变异率14.7%（11/75），明显高于B型的2.4%（1/41）（χ2=4.273，P=0.039）。

表2 HBV基因型与拉米夫定耐药变异类型的关系

讨论

目前，根据HBV的基因多态性，来自不同国家和地区的所有HBV可分为A－H等8个基因型。研究表明[4]，HBV基因型呈明显的地域分布，各国家和地区差异明显，甚至同一国家不同地区的HBV基因型分布也有差异。高俊薇等[1]报道我国11个城市1 214份慢性HBV感染者中，以B、C基因型为主，也存在B＋C混合型感染者，北方地区主要以C基因型为主，南方则以B型为多见。黄重敏于2004年报道[5]桂西30例壮族人群慢性乙肝病毒基因型分布有B、C、D型，其中以D型最多见，其次为C型。吴淋玲于2011年报道[6]120例广西桂北地区慢性乙肝患者中基因型分布，B基因型86例，C基因型24例，B＋C混合型6例，其它4例，以B型为多见。钟大妮于2013年报道[7]广西地区181例HBV感染中B基因型61例、C型基因120例，未见其它基因型或B、C型重叠情况，故以C基因型多见。梧州区域属于广西与广东交界处，本研究发现122例慢性乙肝患者中，检出HBV-B型41例（33.6%），C型75例（61.5%），B+C混合型5例（4.1%），未分型1例（0.8%），未发现D型患者。故以C型为优势株。广西是肝癌高发区之一，多数报道[7-8]以C基因型为主，亦表明肝癌可能与C基因型密切相关。Yang等[9]有类似报道。

本研究尚发现，C基因型中ALT、AST较B基因型显著升高，HBeAg阳性率亦显著高于B基因型，提示C基因型与较严重的HBV感染相关性肝病病情有关，HBeAg转换率低，也可能为经验性抗病毒治疗失败，导致病情加重，更易导致肝硬化、肝癌的发生。Sugauchi等[10]发现，C基因型与ALT持续升高的慢性肝病相关性高于B基因型。大量研究表明[9,11]，C基因型与慢性HBV感染者临床病程的严重程度密切相关。C型易导致肝硬化、肝癌的发生。但与钟大妮报道不大一致[7]，这可能与所处两广交界地界的环境因素及生活习惯有关。

本研究发现未经任何抗病毒治疗患者可存在拉米夫定自然耐药变异基因，发生率为11.5%（14/122），C型患者的耐药基因自然变异率为14.7%（11/75），明显高于B型的2.4%（1/41），亦可能与C基因型与HBV感染较严重的肝病及广西是肝癌高发区相关。本地区未发现阿德福韦酯耐药基因自然变异情况。吴洁[2]报道49例未使用抗病毒治疗的慢性乙肝患者中有7例发生YMDD突变，变异率为14.29%。戴晨阳[12]报道90例未进行抗病毒治疗的慢性乙肝患者中有6例发生变异，变异率为6.67%。故在梧州区域，存在自然耐药变异基因发生率较高，最好在未行任何抗病毒治疗前常规行耐药变异基因检测，以免治疗失败，延误病情。

综上所述，梧州区域HBV感染基因型分布以C基因型多见，存在自然耐药变异基因，且自然耐药变异基因产生C型显著高于B型。C型患者AST、ALT及HBeAg阳性率均高于B型，可能更易导致肝硬化、肝癌的发生。故开展HBV基因型检测不仅有重要的流行病学意义，而且可指导临床用药、判断疾病进程、药物疗效及预后等，由于本研究某些数据样本较少，尚需加大样本量进一步深入研究。

参考文献

1高俊薇,李雅娟,庄辉,等.中国11城市乙型肝炎病毒慢性感染者中乙型肝炎病毒基因型分布.中华流行病学杂志,2007,28(4): 315-318.

2吴洁,覃西.海南地区乙型肝炎基因型与YMDD自然突变的相关性.海南医学院学报,2009,15(7):714-716.

3中华医学会肝病学分会,中华医学会感染病学分会.慢性乙肝诊治指南(2010版).中华肝脏病学杂志,2011,19(1):13-24.

4郑瑞丹,高建平,卢燕辉,等.漳州地区乙型肝炎病毒基因型分布及其临床意义.中华实验和临床感染病杂志(电子版),2011,5(2): 212-219.

5黄重敏,覃亚勤,覃后继,等.桂西壮族人群乙肝病毒基因型研究.中国病毒学,2004,19(2):177-178.

6吴淋玲,杨丽莎,蒋科雪,等.广西桂北地区慢性HBV感染不同免疫状态与HBV基因型关系研究.重庆医学,2011,40(13):1249-1251.

7钟大妮,李国坚,吴继周,等.广西地区乙肝病毒基因分型与临床表现及机体免疫功能关系的研究.中国医学创新,2013,10(2):1-3. 8苏明华,周元平,江建宁,等.乙型肝炎病毒基因型、YMDD变异与拉米夫定治疗后HBV DNA反弹关系的.实用肝脏病杂志, 2008,11(3):154-156.

9Yang HI,Yeh SH,Chen PJ,et a1.Associations between hepatitis B virus genotype and mutants and the risk of hepatocellular carcinoma. J Natl Cancer lnst,2008,100(16):l134-l143.

10 Sugauchi F,Chutaputti A,Orito E,et al.Hepatitis B virus genotype and clinical manifestation among hepatitis B carriers in Thailand.J Gastroeterol Hepatol,2002,17(6):671-676.

11迟晓伟,游晶,张艳梅,等.云南地区慢性乙型肝炎病毒感染者病毒基因型、变异与肝细胞癌的关系.中华消化杂志,2012,32(5): 338-340.

12戴晨阳,刘丽,梁树人,等.658例乙型肝炎患者HBV多位点耐药基因检测结果分析.山东医药,2012,52(7):56-58.

2013-12-26）

（本文编辑：南清振）

10.3961/j.issn.1672-2159.2014.02.009

543002广西梧州市红十字会医院1消化内科；2医学检验科

蔡永林，E-mail：cylzen@163.com

梧州市科技计划项目（201002048）