张蔚　江曙等

摘 要 研究人体肠道细菌对阿魏酸的代谢。采集健康志愿者新鲜粪便，称重稀释后厌氧培养，通过反复涂布分离得到69种人体肠道细菌。采用超高效液相四级杆飞行时间串联质谱技术（UPLCQTOF/MS）与MetabolynxTM软件分析阿魏酸经人体粪便混合菌及分离的单菌作用后的代谢产物，共鉴定出了3种代谢产物，分别是氢化产物、去甲基化产物及去甲氧基化产物；此外，筛选出了对阿魏酸有特殊代谢活性的2种单菌，其中一种为已鉴定了的Bacillus sp.46； 而另一种未知的细菌则用16S核糖体RNA（16S rRNA）技术进行了鉴定，结果表明，此细菌为Enterococcus sp.45。本研究提示肠道细菌对阿魏酸有代谢作用且由不同细菌完成。

关键词 阿魏酸； 肠道细菌； 超高效液相四级杆飞行时间串联质谱技术

1 引 言

人肠道中大约有100多种总数超过108的细菌栖息，其中99%为厌氧菌，这些细菌统称为“肠内细菌群”，共同构成了肠道的微生态环境 [1，2 ]。肠道菌群能产生多种药物代谢酶，主要包括水解酶、氧化还原酶、裂解酶和转移酶等 [3 ]。口服药物进入肠道后，不可避免地在肠道菌群作用下发生代谢转化，产生出具有不同生物活性的代谢产物，因此肠道菌群在人体的药物代谢活动中起着重要作用 [4 ]。

阿魏酸（Ferulic acid），化学名为4羟基3甲氧基苯丙烯酸，是阿魏、川芎、当归、升麻、木贼等多种中药的有效成分之一。药理实验表明，阿魏酸具有效抗血小板凝集和血栓、抗氧化，抗肿瘤、抗突变、增加免疫力等多种作用 [5，6 ]，已成为临床常用的活血祛瘀药物之一。目前，已有大量关于阿魏酸体内代谢研究的报道 [7，8 ]，但有关人体肠道混合菌及单种细菌对阿魏酸的生物转化研究却鲜有报道 [9 ]。本研究采集了健康志愿者新鲜粪便， 通过反复的涂布和培养， 最终分离得到69种人体肠道细菌。采用超高效液相四级杆飞行时间串联质谱技术（UPLCQTOF/MS） 与MetabolynxTM软件 [10 ]寻找阿魏酸与人体肠道混合菌及单菌培养后的代谢产物， 并用16S核糖体RNA技术 （16S rRNA）对具有特殊代谢活性的细菌进行了鉴定， 鉴定出了对阿魏酸具有代谢活性的细菌，为全面了解肠道细菌对阿魏酸的代谢提供了依据。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

UPLC AcquityTM系统 （Waters公司）；SynaptTM QTOF 质谱仪 （Waters公司），配有电喷雾离子源 （ESI）；Masslynx 4.1质谱工作站软件 （Waters公司）；MetaboLynxTM分析软件（Waters公司）；MLS3750型高压蒸汽灭菌器（SANYO公司）；GNP9080型隔水式恒温培养箱（上海三发科学仪器有限公司）；WD9402A型PCR扩增仪（北京六一仪器公司）；DYY8C电泳仪（北京六一仪器公司）；TGL16B高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；XW80A微型涡旋混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）；TD2102电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；EPED型超纯水系统（南京易普达易科技发展有限公司）。

阿魏酸（中国药品生物制品检定所，批号 110773201012）；PfuX7（DNA聚合酶）、Pfu buffer（聚合酶链式反应缓冲液）、dNTPs（4种脱氧核糖核酸）、DNA提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒（上海博亚生物技术有限公司）；乙腈与甲酸为色谱纯，其余试剂为分析纯。

准确称取阿魏酸对照品适量，用超纯水超声溶解，配制成2.0 g/L标准溶液， 4 ℃中保存备用。

2.2 普通厌氧培养液（GAM）的配制、灭菌

称取胰蛋白胨10.00 g，大豆蛋白胨3.00 g，朊胨10.00 g，酵母浸膏5.00 g，血清消化粉13.50 g，牛肝浸出粉1.20 g，牛肉膏2.20 g，葡萄糖3.00 g，KH2PO4 2.50 g，NaCl 3.00 g，可溶性淀粉5.00 g，L半胱氨酸盐0.30 g，硫代乙醇酸钠0.30 g，用超纯水加热溶解，调节至pH 7.2并最终定容至1000 mL。准确称取2.70 g NaCl，用超纯水定容至300 mL。将厌氧培养液及生理盐水在121℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌20 min，冷却备用 [11 ]。

2.3 人体肠道菌液的制备及细菌的分离、培养

收集健康女性志愿者（受试者无肠道疾病或代谢性疾病史，且在采样前3个月内未服用过任何抗生素或益生素）的新鲜粪便5.0 g，与生理盐水按比例1 ∶ 4 （g/mL）比例混合，涡旋2 min制成混悬液，再1000 r/min离心10 min得上清液，即为肠道菌液 [12 ]。 将肠道菌液加到生理盐水中连续稀释，吸取0.1 mL适当浓度的稀释液接种在GAM琼脂平板上， 均匀涂布，并在37 ℃厌氧培养。经过传代驯化和反复平板涂布，分离出69种细菌，标号为sp.1～sp.69并冷冻保存在4℃冰箱中，以便后面研究使用 [13 ]。

摘 要 研究人体肠道细菌对阿魏酸的代谢。采集健康志愿者新鲜粪便，称重稀释后厌氧培养，通过反复涂布分离得到69种人体肠道细菌。采用超高效液相四级杆飞行时间串联质谱技术（UPLCQTOF/MS）与MetabolynxTM软件分析阿魏酸经人体粪便混合菌及分离的单菌作用后的代谢产物，共鉴定出了3种代谢产物，分别是氢化产物、去甲基化产物及去甲氧基化产物；此外，筛选出了对阿魏酸有特殊代谢活性的2种单菌，其中一种为已鉴定了的Bacillus sp.46； 而另一种未知的细菌则用16S核糖体RNA（16S rRNA）技术进行了鉴定，结果表明，此细菌为Enterococcus sp.45。本研究提示肠道细菌对阿魏酸有代谢作用且由不同细菌完成。

关键词 阿魏酸； 肠道细菌； 超高效液相四级杆飞行时间串联质谱技术

1 引 言

人肠道中大约有100多种总数超过108的细菌栖息，其中99%为厌氧菌，这些细菌统称为“肠内细菌群”，共同构成了肠道的微生态环境 [1，2 ]。肠道菌群能产生多种药物代谢酶，主要包括水解酶、氧化还原酶、裂解酶和转移酶等 [3 ]。口服药物进入肠道后，不可避免地在肠道菌群作用下发生代谢转化，产生出具有不同生物活性的代谢产物，因此肠道菌群在人体的药物代谢活动中起着重要作用 [4 ]。

阿魏酸（Ferulic acid），化学名为4羟基3甲氧基苯丙烯酸，是阿魏、川芎、当归、升麻、木贼等多种中药的有效成分之一。药理实验表明，阿魏酸具有效抗血小板凝集和血栓、抗氧化，抗肿瘤、抗突变、增加免疫力等多种作用 [5，6 ]，已成为临床常用的活血祛瘀药物之一。目前，已有大量关于阿魏酸体内代谢研究的报道 [7，8 ]，但有关人体肠道混合菌及单种细菌对阿魏酸的生物转化研究却鲜有报道 [9 ]。本研究采集了健康志愿者新鲜粪便， 通过反复的涂布和培养， 最终分离得到69种人体肠道细菌。采用超高效液相四级杆飞行时间串联质谱技术（UPLCQTOF/MS） 与MetabolynxTM软件 [10 ]寻找阿魏酸与人体肠道混合菌及单菌培养后的代谢产物， 并用16S核糖体RNA技术 （16S rRNA）对具有特殊代谢活性的细菌进行了鉴定， 鉴定出了对阿魏酸具有代谢活性的细菌，为全面了解肠道细菌对阿魏酸的代谢提供了依据。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

UPLC AcquityTM系统 （Waters公司）；SynaptTM QTOF 质谱仪 （Waters公司），配有电喷雾离子源 （ESI）；Masslynx 4.1质谱工作站软件 （Waters公司）；MetaboLynxTM分析软件（Waters公司）；MLS3750型高压蒸汽灭菌器（SANYO公司）；GNP9080型隔水式恒温培养箱（上海三发科学仪器有限公司）；WD9402A型PCR扩增仪（北京六一仪器公司）；DYY8C电泳仪（北京六一仪器公司）；TGL16B高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；XW80A微型涡旋混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）；TD2102电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；EPED型超纯水系统（南京易普达易科技发展有限公司）。

阿魏酸（中国药品生物制品检定所，批号 110773201012）；PfuX7（DNA聚合酶）、Pfu buffer（聚合酶链式反应缓冲液）、dNTPs（4种脱氧核糖核酸）、DNA提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒（上海博亚生物技术有限公司）；乙腈与甲酸为色谱纯，其余试剂为分析纯。

准确称取阿魏酸对照品适量，用超纯水超声溶解，配制成2.0 g/L标准溶液， 4 ℃中保存备用。

2.2 普通厌氧培养液（GAM）的配制、灭菌

称取胰蛋白胨10.00 g，大豆蛋白胨3.00 g，朊胨10.00 g，酵母浸膏5.00 g，血清消化粉13.50 g，牛肝浸出粉1.20 g，牛肉膏2.20 g，葡萄糖3.00 g，KH2PO4 2.50 g，NaCl 3.00 g，可溶性淀粉5.00 g，L半胱氨酸盐0.30 g，硫代乙醇酸钠0.30 g，用超纯水加热溶解，调节至pH 7.2并最终定容至1000 mL。准确称取2.70 g NaCl，用超纯水定容至300 mL。将厌氧培养液及生理盐水在121℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌20 min，冷却备用 [11 ]。

2.3 人体肠道菌液的制备及细菌的分离、培养

收集健康女性志愿者（受试者无肠道疾病或代谢性疾病史，且在采样前3个月内未服用过任何抗生素或益生素）的新鲜粪便5.0 g，与生理盐水按比例1 ∶ 4 （g/mL）比例混合，涡旋2 min制成混悬液，再1000 r/min离心10 min得上清液，即为肠道菌液 [12 ]。 将肠道菌液加到生理盐水中连续稀释，吸取0.1 mL适当浓度的稀释液接种在GAM琼脂平板上， 均匀涂布，并在37 ℃厌氧培养。经过传代驯化和反复平板涂布，分离出69种细菌，标号为sp.1～sp.69并冷冻保存在4℃冰箱中，以便后面研究使用 [13 ]。

摘 要 研究人体肠道细菌对阿魏酸的代谢。采集健康志愿者新鲜粪便，称重稀释后厌氧培养，通过反复涂布分离得到69种人体肠道细菌。采用超高效液相四级杆飞行时间串联质谱技术（UPLCQTOF/MS）与MetabolynxTM软件分析阿魏酸经人体粪便混合菌及分离的单菌作用后的代谢产物，共鉴定出了3种代谢产物，分别是氢化产物、去甲基化产物及去甲氧基化产物；此外，筛选出了对阿魏酸有特殊代谢活性的2种单菌，其中一种为已鉴定了的Bacillus sp.46； 而另一种未知的细菌则用16S核糖体RNA（16S rRNA）技术进行了鉴定，结果表明，此细菌为Enterococcus sp.45。本研究提示肠道细菌对阿魏酸有代谢作用且由不同细菌完成。

关键词 阿魏酸； 肠道细菌； 超高效液相四级杆飞行时间串联质谱技术

1 引 言

人肠道中大约有100多种总数超过108的细菌栖息，其中99%为厌氧菌，这些细菌统称为“肠内细菌群”，共同构成了肠道的微生态环境 [1，2 ]。肠道菌群能产生多种药物代谢酶，主要包括水解酶、氧化还原酶、裂解酶和转移酶等 [3 ]。口服药物进入肠道后，不可避免地在肠道菌群作用下发生代谢转化，产生出具有不同生物活性的代谢产物，因此肠道菌群在人体的药物代谢活动中起着重要作用 [4 ]。

阿魏酸（Ferulic acid），化学名为4羟基3甲氧基苯丙烯酸，是阿魏、川芎、当归、升麻、木贼等多种中药的有效成分之一。药理实验表明，阿魏酸具有效抗血小板凝集和血栓、抗氧化，抗肿瘤、抗突变、增加免疫力等多种作用 [5，6 ]，已成为临床常用的活血祛瘀药物之一。目前，已有大量关于阿魏酸体内代谢研究的报道 [7，8 ]，但有关人体肠道混合菌及单种细菌对阿魏酸的生物转化研究却鲜有报道 [9 ]。本研究采集了健康志愿者新鲜粪便， 通过反复的涂布和培养， 最终分离得到69种人体肠道细菌。采用超高效液相四级杆飞行时间串联质谱技术（UPLCQTOF/MS） 与MetabolynxTM软件 [10 ]寻找阿魏酸与人体肠道混合菌及单菌培养后的代谢产物， 并用16S核糖体RNA技术 （16S rRNA）对具有特殊代谢活性的细菌进行了鉴定， 鉴定出了对阿魏酸具有代谢活性的细菌，为全面了解肠道细菌对阿魏酸的代谢提供了依据。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

UPLC AcquityTM系统 （Waters公司）；SynaptTM QTOF 质谱仪 （Waters公司），配有电喷雾离子源 （ESI）；Masslynx 4.1质谱工作站软件 （Waters公司）；MetaboLynxTM分析软件（Waters公司）；MLS3750型高压蒸汽灭菌器（SANYO公司）；GNP9080型隔水式恒温培养箱（上海三发科学仪器有限公司）；WD9402A型PCR扩增仪（北京六一仪器公司）；DYY8C电泳仪（北京六一仪器公司）；TGL16B高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；XW80A微型涡旋混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）；TD2102电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；EPED型超纯水系统（南京易普达易科技发展有限公司）。

阿魏酸（中国药品生物制品检定所，批号 110773201012）；PfuX7（DNA聚合酶）、Pfu buffer（聚合酶链式反应缓冲液）、dNTPs（4种脱氧核糖核酸）、DNA提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒（上海博亚生物技术有限公司）；乙腈与甲酸为色谱纯，其余试剂为分析纯。

准确称取阿魏酸对照品适量，用超纯水超声溶解，配制成2.0 g/L标准溶液， 4 ℃中保存备用。

2.2 普通厌氧培养液（GAM）的配制、灭菌

称取胰蛋白胨10.00 g，大豆蛋白胨3.00 g，朊胨10.00 g，酵母浸膏5.00 g，血清消化粉13.50 g，牛肝浸出粉1.20 g，牛肉膏2.20 g，葡萄糖3.00 g，KH2PO4 2.50 g，NaCl 3.00 g，可溶性淀粉5.00 g，L半胱氨酸盐0.30 g，硫代乙醇酸钠0.30 g，用超纯水加热溶解，调节至pH 7.2并最终定容至1000 mL。准确称取2.70 g NaCl，用超纯水定容至300 mL。将厌氧培养液及生理盐水在121℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌20 min，冷却备用 [11 ]。

2.3 人体肠道菌液的制备及细菌的分离、培养

收集健康女性志愿者（受试者无肠道疾病或代谢性疾病史，且在采样前3个月内未服用过任何抗生素或益生素）的新鲜粪便5.0 g，与生理盐水按比例1 ∶ 4 （g/mL）比例混合，涡旋2 min制成混悬液，再1000 r/min离心10 min得上清液，即为肠道菌液 [12 ]。 将肠道菌液加到生理盐水中连续稀释，吸取0.1 mL适当浓度的稀释液接种在GAM琼脂平板上， 均匀涂布，并在37 ℃厌氧培养。经过传代驯化和反复平板涂布，分离出69种细菌，标号为sp.1～sp.69并冷冻保存在4℃冰箱中，以便后面研究使用 [13 ]。