刘大军 秦智伟 周秀艳 辛 明 武 涛

（1东北农业大学园艺学院，黑龙江哈尔滨 150030；2哈尔滨市农业科学院，黑龙江哈尔滨 150070）

利用SSH技术鉴定黄瓜抗霜霉病相关基因

刘大军1，2秦智伟1*周秀艳1辛 明1武 涛1

（1东北农业大学园艺学院，黑龙江哈尔滨 150030；2哈尔滨市农业科学院，黑龙江哈尔滨 150070）

采用SSH技术对黄瓜抗霜霉病自交系M801-3-1侵染霜霉病菌前后的差异表达基因进行了研究。利用 SSH 技术构建抗病黄瓜材料接种霜霉病菌和未接种差异表达的差减cDNA文库。经反向Northern blot杂交检测，共得到48个阳性克隆。利用分子生物学软件对测序后的序列进行质量检测和聚类、拼接，共得到 14个UniESTs，其中包括8个singletons和6个contigs。通过SSH-EST代表基因功能的分析，说明抗氧化胁迫能力和叶绿体的重建和保护机制对抗病品种抗病有重要作用。同时，提出SSH-EST代表的clpb、HSP70、HSP22和肽脯氨酰顺反异构酶还可能参与了R基因介导的防御反应，smHSP有可能就是R蛋白的“保卫靶”，负责监测细胞内的异常，这一发现为揭示活性氧机制和R基因介导的防卫机制之间的关系提供了关键证据。

黄瓜；霜霉病；SSH技术

黄瓜霜霉病是由卵菌纲的古巴假霜霉病菌（Pseudoperonospora cubensis）引起的。黄瓜生产中霜霉病是具有毁灭性的叶部病害，近年来随着病原菌的变异，有加速流行的趋势。Helena等（2011）结合前人的研究对黄瓜霜霉病抗性遗传的相关问题进行了系统的论述（刘艳玲 等，2009；李建武，2010）。人们已经对黄瓜霜霉病的发病过程十分了解（石延霞，2002；刘艳玲 等，2009），利用药剂防治已经可以在一定程度上控制该病的发生（朱书生，2005；张晓，2008；乔桂双，2009），但药剂的使用存在食品安全问题和环境问题，同时也存在霜霉病菌的抗药性问题（刘晓宇，2004）。培育并使用抗病品种无疑是减轻该病危害的最有效措施（Branca et al.，2005；李建武，2010；牛德 ，2010）。因此，黄瓜抗霜霉病基因的发掘和黄瓜抗霜霉病机制的深入研究对于黄瓜抗霜霉病育种和黄瓜生产实践具有重要意义。

抑制性差减杂交（SSH）技术是由Diatchenko等（1996）提出。Yang等（1999）将SSH技术与微阵列筛选技术进行了有机结合，大大提高了鉴定差别表达基因检测的效率。SSH技术现在已经成功应用于抗病基因分离的研究。骆蒙（2001）构建了白粉病诱导小麦叶片的特异性差减文库，获得大量EST序列，根据这些EST推测肌醇脂信号系统、SA信号系统、MAP相关信号传递系统可能参与小麦白粉病过程。于秀梅（2006）构建了小麦接种条锈菌后不同时间的cDNA文库，共获得652个抗病相关基因和抗病信号转导相关的Unigenes。刘蕾等（2012）构建了青枯菌侵染相关的抑制性差减杂交文库，筛选出44个差异表达基因，并利用基因敲出技术对差异表达进行功能验证。赵胡 （2012）构建了镉胁迫的SSH文库，分离出600个独立克隆。Norelli等（2009）构建了苹果火疫病侵染前后的SSH文库，获得468个非冗余序列，并得出侵染前后表达基因不同的结果。Verica等（2004）利用SSH技术构建了可可叶片受病害相关激素类物质 BTH、JAS、ET和诱导子蛋白Nep1处理的差异表达EST文库，鉴定出330个防卫反应相关基因。Peng等（2009）利用SSH构建了绿僵菌产孢细胞发育过程中优先表达的特异基因文库，共获得109个EST，推测这些基因参与绿僵菌产孢的发育调节。Zhao等（2008）利用SSH技术构建了水稻纹枯病侵染水稻cDNA文库，获得50个差异表达克隆，发现这些基因中有25个与水稻稻瘟病和水稻白叶枯病侵染表达基因相同，并认为真菌和细菌的防御响应基因是相同的。

前人已经对黄瓜霜霉病的发病规律、黄瓜抗霜霉病机制做了大量研究。丁国华等（2005）采用抗病基因类似序列（resistance gene analog，RGA）克隆和标记基因的策略，获得了15个RGA片段。李金鑫（2007）以抗霜霉病黄瓜东农129为试材，利用差异显示反转录聚合酶链式反应（DDRT-PCR）研究了黄瓜接种霜霉病菌前后基因表达的差异，鉴定出了4个抗病相关基因。王丽娟等（2010）以抗霜霉病黄瓜品种649的叶片为材料，接种黄瓜霜霉病菌后，构建了黄瓜叶片全长cDNA文库，得到427个与植物防御、抗病相关的基因。李建吾等（2011）以高抗霜霉病的黄瓜自交系为材料，构建了两个抑制差减文库，经反向Northern杂交筛选、测序和序列比对，筛选到3个未知功能抗病相关基因。Taler等（2004）通过部分测序甜瓜的抗霜霉病的差异蛋白得到2个基因At1和At2，转基因试验证明基因At1和At2可提高感病甜瓜品种的抗霜霉病能力。康静（2007）分别从甜瓜和黄瓜上克隆出了At2基因，并将其转入黄瓜得到转基因植株。黄瓜基因组测序完成后，大量黄瓜R基因被鉴定出来，At基因也被鉴定出来，并被列为黄瓜抗霜霉病的重要候选基因（Huang et al.，2009）。Taler等（2004）指出与经典的R基因不同的是，基因At1和At2属酶促抗性（enzymatic resistance）基因，简称eR基因，同时说明在甜瓜中可能也存在R基因介导的霜霉病抗性，只是目前尚未发现。本试验在基因组测序已经完成的背景下，利用抑制性差减杂交（SSH）技术获得多个与霜霉病菌侵染相关的EST序列，通过BLAST比对确定黄瓜基因组中与EST序列同源的基因，以期明确黄瓜抗霜霉病的相关基因的表达机制和黄瓜抗霜霉病的分子机制。

1 材料与方法

1.1 供试材料与处理方法

试验于2010年秋在哈尔滨市农业科学院实验基地进行。以东北农业大学黄瓜课题组选育的抗霜霉病自交系M801-3-1和感病自交系M302-3为材料。在黄瓜霜霉病田间发病时从黄瓜病叶上收集病原菌，并在感病自交系M302-3上进行纯化，接种后的叶片发病时收集病原菌。培育健康的M801-3-1幼苗，二叶一心时接种黄瓜霜霉病菌孢子悬浮液，孢子囊浓度为1×105个·mL-1，以喷施清水为对照，喷施于真叶的背面，放入光照培养室，温度22 ℃，空气湿度100%，塑料袋覆盖幼苗，避免光照培养室内空气流动造成叶片萎蔫，先24 h黑暗处理，之后，光周期为12 h/12 h（光照/黑暗）。在接种后的0、6、12、24、48、72 h取植株叶片，液氮处理后在-80 ℃中保存。

1.2 mRNA的分离和提取

使用TaKaRa 公司的 RNAiso Plus and RNAiso Mate for Plant Tissue 试剂盒进行总 RNA 的提取。mRNA 的分离、纯化使用 A.P mRNA Purification Kit，纯化后检测 mRNA 样品的浓度及纯度。

1.3 SSH cDNA 文库的构建

SSH的全过程参考Clontech公司的PCRSelectTMcDNA Subtraction Kit使用手册进行。以0～72 h侵染处理的混合试材作为 tester，将清水对照作为 driver。首先将分离、纯化后的 mRNA进行反转录，得到双链 cDNA，用 RsaⅠ对双链 cDNA 进行酶切，在tester 两端加上接头1和接头2R，进行2 次消减和2次 PCR扩增，富集差异表达基因。第1次PCR 反应体系：无菌水19.5 μL，10×PCR 反应缓冲液2.5 μL，dNTP（10 μmol·L-1） 0.5 μL，PCR 引物 1（10 μmol·L-1） 2.0 μL，50×Advantage cDNA Polymerase Mix 0.5 μL，总体积25.0 μL。第1次循环体系：27 个循环， 94 ℃30 s、66 ℃30 s、72 ℃1.5 min。第2次PCR 反应体系：无菌水18.5 μL，10×PCR 反应缓冲液2.5 μL，巢式引物1、巢式引物2R（10 μmol·L-1） 各 1.0 μL，dNTP（10 μmol·L-1） 0.5 μL，50×Advantage cDNA Polymerase Mix 0.5 μL，总体积24.0 μL。第2次循环体系：10～12 个循环，94 ℃ 30 s、68 ℃30 s、72 ℃1.5 min。引物和序列如下。接头1 序列：5'-CTAATACGACTCACTATAGGG CTCGAGCGGCCGCCGCCCGGGCAGGT-3'，5'-ACC TGCCCGG-3'；接头2R序列：5'-CTAATACGACTCACTATAGG GCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'，5'-ACCTCGGCCG-3'。引 物1：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC -3'。巢式引物1：5'-TCGAGCGGCCGCCGCCCGGGCAGGT-3'。巢式引物2R：5'-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'（接头1和接头2R的序列、巢式引物序列根据手册提供序列）。

1.4 差减文库生成

两次扩增产物用TaKaRa公司DNA Fragment Purification Kit Ver 2.0进行纯化，与pMD19-T载体连接，转化感受态细胞GM109，在Amp/IPTG/X-Gal培养基上鉴定阳性克隆。挑取单个白斑菌落进行振荡培养，用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver 2.0提取质粒。

1.5 反向Northern blot鉴定阳性克隆

制备探针：将0～72 h侵染处理的混合试材和清水对照试材分离、纯化后的mRNA进行反转录，得到双链cDNA，用RsaⅠ对双链cDNA进行酶切，分别用地高辛（Roche）进行标记，检测标记效率。

反向Northern验证阳性克隆：利用巢式引物1（5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'）和 巢式引物2R（5'-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'）对提取的质粒进行扩增。取扩增产物1 μL点在immobilon-Ny+带正电尼龙转印膜上，用标记好的探针与点阵膜进行杂交，具体操作方法参照Roche DIG-High Prime DNA Lableing and Detection Starter KitⅡ试剂盒的操作说明。

1.6 差异表达基因的测序及序列分析

1.6.1 序列前处理和聚类拼接 将经过反向Northern blot验证后有差异的阳性克隆送去测序。将测序后的数据进行前处理。首先利用vecscreen软件或http：//ncbi.nlm.nih. gov/repository/vector 去除载体序列，再利用 RepBase（http：//www.girinst.org）去除重复和低质量序列。将前处理后的序列利用CAP3软件进行EST Cluster分析。

1.6.2 序列分析 将所有序列在NCBI上进行BLASTn和BLASTx同源性比对，并且利用geneontology（http：//www.geneontology.org）进行功能分类。

2 结果与分析

2.1 总RNA 的提取及 mRNA 的分离纯化

经纯度、浓度检测，提取的总RNA的质量符合试验标准，OD260/OD280在 1.8～2.0。经1%琼脂糖凝胶电泳检测，RNA 的带形清晰，亮度比值约为2∶1，表明提取的 RNA没有被降解。 纯化的mRNA 呈抹状弥散，说明 mRNA的质量较好，可以用于构建差减文库。

图1 琼脂糖凝胶电泳检测提取RNA的质量

2.2 差异表达 cDNA 文库的建立

将第2次PCR产物回收、纯化，连接到pMD19-T载体上，在含有Amp/IPTG/X-gal的培养基上培养过夜。随机挑取文库中的 1 000个阳性克隆，利用巢式引物 1 和巢式引物 2R 进行验证，如图 2 所示，片段分布主要集中在 100～500 bp，符合预期RsaⅠ酶切产物大小，说明阳性克隆中含有第2次PCR回收产物。随机选取80个阳性克隆进行反向Northern blot鉴定。

图2 cDNA文库PCR验证

2.3 反向Northern blot鉴定阳性克隆

将差减文库中的PCR产物点在尼龙膜上，进行点阵列杂交筛选。试验设计为差异表达cDNA文库和两个探针。选取出现在tester探针杂交膜上但未出现在 driver探针杂交膜上的阳性克隆，或在tester杂交膜和driver杂交膜上均出现，但信号强度有差别的阳性克隆。图3为差减cDNA文库的反向Northern blot验证。最后确定48个阳性克隆进行测序。

图3 反向Northern blot验证

2.4 cDNA差异表达文库序列分析

对利用反向Northern blot验证得到的48个阳性克隆进行测序，获得Est序列，通过CAP3软件进行聚类拼接获得6个重叠群Est（Contig1～6），8个独立Est（53、70、73、33、17、52、61、77）。测序拼接结果在黄瓜基因组数据库和NCBI上进行BLAST 氨基酸序列同源性比对，结果显示有11个Est找到了与之匹配的序列，其中包括4个功能未知的序列（表1）。另外，还有未找到任何比对信息的3个序列（Contig3、17、52），推测这3个序列可能为新Est序列。

表1 SSH-EST序列黄瓜基因组比对信息

3 讨论

前人已经对黄瓜的抗霜霉病基因进行了大量研究，认为黄瓜的抗霜霉病基因是由多对隐性基因控制的（Shimizu et al.，1963；Doruchowski & Lakowska-Ryk，1992；张胜菊和司龙亭，2009）。黄瓜抗霜霉病的机制相对于其他病害更加复杂，这可能是至今为止没有明确地发现黄瓜抗霜霉病基因的主要原因。牛德（2010）构建了接种霜霉病菌后4、8、16、24、48 h和72 h的抗霜霉病黄瓜品种649的叶片全长cDNA文库，结果显示：共有1 851个unigengs获得相关的注释信息，涉及44个非重复代谢途径。接种霜霉病菌后的叶片cDNA文库包含抗霜霉病相关基因，但更多的是与霜霉病抗性非相关的基因，这一结果使得后续进行抗病基因发掘和抗病机制分析的难度较大。李建武（2010）以高抗自交系IL57经霜霉病菌接种32、48、56 h后和清水接种对照的叶片为材料，采用SSH技术构建了富集黄瓜霜霉病抗性相关基因的正、反向差减文库，从正、反向差减文库中分别得到了60个和26个非重复序列片段（singleton ESTs）。差减出的相关功能基因几乎涉及了植物防御病原菌侵染的全部反应过程并且与抗病反应高度相关。

本试验是以本课题组培育的高代抗病自交系M801-3-1为材料，在接种后的0、6、12、24、48、72 h取样，获得有效Est序列48个，通过CAP3软件进行聚类拼接获得6个重叠群Est（Contig1～6），8个独立Est。相对于牛德（2010）的试验结果，本试验采用SSH技术更有利于霜霉病侵染相关基因的发现，结果分析更简便，针对性更强。相对于李建武（2010）的试验结果，本试验增加了早期取样，早期取样更能反映在黄瓜与霜霉病菌接触的第一时间黄瓜做出的抗病性转录反应，有利于揭示黄瓜抗病反应的整个机制，尤其是前期的信号传导机制和早期的应激反应机制。同时，由于试验材料、取样时间和操作方法的不同，本试验获得的Est与前人的研究结果有很大不同，后续将进行转录组测序试验验证本试验结果的可靠性。李建武（2010）的研究认为活性氧诱发的过敏性抗病机制在黄瓜抗霜霉病中起重要作用，本试验结果则表明降低过敏性的抗活性氧机制有助于提高抗性。

生物信息学分析显示本试验中SSH-EST片段的表达和活性氧引起的应激反应有关，高温、低温、强光、生物侵染等逆境都能诱发上述基因的表达。逆境引起的活性氧伤害主要伤害生物膜和蛋白质。清除或减少活性氧有助于减轻逆境造成的伤害。同时本试验的结果也为石延霞（2002）关于高温提高黄瓜抗霜霉病能力的试验结果提供了分子水平的解释，即热激蛋白等热激反应产物的产生不但提高了黄瓜的抗热性，也提高了黄瓜抗霜霉病的能力。顾振芳等（2004）研究证实，黄瓜叶片中叶绿素的含量与黄瓜品系对霜霉病的抗性呈正相关。本试验观察到的谷胱甘肽硫转移酶、HSP22、16S核糖体、clpb这些生物大分子的超量表达都和叶绿体的重建或保护机制有关。黄瓜抗霜霉病品种一般叶色较深，根本原因是因为细胞内叶绿体较多，本试验结果表明，维持叶绿体稳定的机制和促进叶绿体形成的机制都有利于提高黄瓜抗霜霉病的能力。叶绿体的组成元件细胞色素和铁氧还原蛋白等对活性氧极为敏感，逆境中保护叶绿体内成分的稳定是黄瓜能否生存的关键，谷胱甘肽硫转移酶具有清除活性氧的功能，铁硫簇蛋白能够促进铁氧还原蛋白的形成，保持内环境的稳定。另外，HSP22、HSP20、HSP70、clpb和肽脯氨酰异构酶含量的变化可能构成黄瓜过敏性反应的信号，这些成分的大量表达可能标志着黄瓜的内平衡受到破坏，信号进一步传递给R基因形成系统性过敏坏死反应，即HR反应。

总之，黄瓜维持叶绿体内环境的稳定和启动叶绿体重建机制是抗霜霉病品种抗病机制的重要组成部分。只有维持黄瓜自身代谢的良性运转才能为抗病反应提供足够的能源和材料。叶绿体可能是黄瓜与霜霉病病原菌生存竞争的“焦点”。

4 结论

本试验利用 SSH 技术构建抗病黄瓜材料接种霜霉病病原菌和未接种差异表达的差减cDNA文库。经反向 Northern blot杂交检测，共得到48个阳性克隆。利用分子生物学软件对测序后的序列进行质量检测和聚类、拼接，共得到 14个 UniESTs，其中包括 8个 singletons 和 6个contigs。将上述 EST序列在黄瓜基因组数据库（http：//www.icugi.org/）上进行 BLAST比对，有11个 EST 片段找到了与之匹配的同源序列，有3个 EST 片段未找到同源序列，推测可能是新基因。通过SSH-EST代表基因功能的分析，推论出抗氧化胁迫能力、叶绿体的重建和保护机制对抗病品种抗病有重要作用。同时SSH-EST代表的clpb、HSP70、HSP22和肽脯氨酰顺反异构酶还可能参与了R基因介导的防御反应，smHSP有可能就是R蛋白的“保卫靶”，负责监测细胞内的异常。

本试验获得的UniESTs虽然有限但更有针对性，大多和活性氧反应相关，活性氧迅速产生可使黄瓜在受侵染部位产生过敏性坏死反应，非侵染部位抑制活性氧产生可使坏死斑受限制形成抗病反应。活性氧应激反应一方面反映了黄瓜受霜霉病菌侵染后对于自身内环境的平衡性修复需要，另一方面也可能作为逆境信号的传导机制，启动黄瓜抗病的形态建成和生理环境。活性氧应激反应在其他温度逆境、水分逆境、光照逆境和生物侵染逆境中可能具有相似作用。利用活性氧应激反应的相关理论可以育成更加抗病的黄瓜品种，也可以制定出相应的栽培技术措施进行黄瓜病害的综合防治。

今后可利用RNAi干扰技术敲出和超量表达SSH-EST相关基因，验证这些基因在黄瓜抗霜霉病中的功能。也可以利用转录组测序技术，进一步分析引起黄瓜不同品种产生抗感差异的机制。

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Using SSH Technology to Identify Relevant Genes Resistant to Cucumber Downy Mildew

LIU Da-jun1，2，QIN Zi-wei1，ZHOU Xiu-yan1，XING Ming1，WU Tao1

（1HorticultureCollege，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，Heilongjiang，China;2HarbinCityAgriculturalInstitute，Harbin150070，Heilongjiang，China）

Adopting SSH technology，this paper studied on the difference expressive genes of downy mildew resistant cucumber inbred line ‘M801-3-1’ before and after the infection of downy mildew．Diseaseresistant cucumber material vaccinated downy mildew and unvaccinated cDNA library was constructed using SSH technology．Forty-eight positive clones were obtained by reverse Northern blot hybridization detection，and 14 UniESTs were obtained including 8 singletons and 6 contigs via molecular biology software．The SSH-EST genes function analysis indicated that oxidative stress resistance and chloroplast reconstruction and protection mechanisms had very important role on disease resistance．At the same time，the paper put forward that Clpb，HSP70，HSP22 and peptidyl-prolyl cis-trans isomerase might be involved in the R gene-mediated defense reaction，and smHSP might be the ‘defending target’ of R protein，responsible for monitoring intracellular exception．This study has provided a key evidence for revealing the relations between active oxygen mechanism and R gene mediate protection mechanism．

Cucumber; Downy mildew; SSH technology

刘大军，男，博士研究生，高级农艺师，专业方向：黄瓜育种和菜豆育种，E-mail：jianlongedu@163.com

*通讯作者（Corresponding author）：秦智伟，男，教授，博士生导师，专业方向：黄瓜遗传育种，E-mail：zwqin727@163.con

2013-06-28；接受日期：2013-11-15

国家自然科学基金项目（31272158），“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD02B03），农业部“东北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室”项目，黑龙江省寒地蔬菜生物学重点实验室项目