马耀宏，孟庆军，杨艳，杨俊慧，崔进梅

（1.山东省科学院生物研究所，山东省生物传感器重点实验室，山东济南250014；2.山东技师学院，山东济南250014）

大曲糖化力的快速测定方法

马耀宏1，孟庆军1，杨艳1，杨俊慧1，崔进梅2

（1.山东省科学院生物研究所，山东省生物传感器重点实验室，山东济南250014；2.山东技师学院，山东济南250014）

糖化力为大曲质量控制的主要指标，准确快速的测定糖化力对大曲生产质量的控制具有重要意义。该文用还原糖测定仪建立了大曲糖化力快速测定方法，并与常规手工滴定方法进行比较。测定结果显示，还原糖测定仪法变异系数较手工方法小，回收率也优于手工方法。此法可作为酒曲中糖化力快速测定方法。

糖化力；大曲；还原糖；还原糖测定仪

“曲是酒之骨”[1-2]。在酿酒生产过程，大曲对于提高出酒率、降低粮耗、增加优质品率、保持香型稳定等方面有着重要的作用[3-5]。糖化力是衡量大曲糖化作用强弱的一个重要指标，指的是大曲中具有糖化作用的酶及微生物将淀粉转化为糖分的能力[2，6-7]。大曲糖化力的高低受原料结构、上霉情况及大火期温度等诸多因素的影响[7-9]，是大曲最为重要的理化指标之一。糖化力的准确快速测定对指导生产起着重要作用。目前国内糖化力的测定方法主要是采用手工滴定方法，也有采用流动分析仪和生化分析仪测定糖化力的报道[10-13]。本研究应用还原糖测定仪对大曲糖化力测定进行较系统的研究，并与手工滴定方法进行比较，建立了一种基于还原糖测定仪的大曲糖化力快速分析方法[14]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 大曲

清香型大曲由山西某酒厂提供，分别记为1#、2#、3#和4#样品。

大曲样液制备：根据测得大曲试样的水分，称取相当于绝干试样量10g，精确至0.001g，放入250mL烧杯中，加20mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液，再加水，用玻璃棒搅拌均匀，定容至200mL。将上述烧杯置于35℃恒温水浴中保温浸渍1h，过滤，收集滤液，备用。

1.1.2 其他试剂

斐林试剂甲液：称取15.6g硫酸铜（CuSO4·5H2O）及0.05g次甲基蓝溶于蒸馏水中，并定容至1 000mL。

斐林试剂乙液：称取50g酒石酸钾钠及54g氢氧化钠溶于蒸馏水中，再加入4g亚铁氯化钾，完全溶解后，用蒸馏水定容至1 000mL。

0.25 %标准葡萄糖溶液：称取105℃烘箱中干燥至质量恒定的分析纯葡萄糖2.5g（精确称取至0.1mg），溶于蒸馏水中并稀释定容至l 000mL。

pH4.6醋酸-醋酸钠缓冲液：2mol/L醋酸：取118mL冰醋酸用水稀释至1L；2mol/L醋酸钠：称取醋272g酸钠（CH3COONa·3H2O）溶于水，稀释至1L。将两溶液等体积混合，即为pH4.6醋酸-醋酸钠缓冲液。

20%氢氧化钠溶液：称取20g氢氧化钠，溶于水，稀释至100mL。

20g/L可溶性淀粉溶液：用分析天平准确称取干燥后的可溶性淀粉2g（精确到0.001g），于50mL烧杯中用少量水调匀后，倒入盛有70mL沸水的150mL烧杯中，并用20mL水洗净50mL小烧杯，洗液合并其中，用微火煮沸至透明，冷却后用水定容至100mL。

1.1.3 还原糖测定仪法试剂

斐林甲液：硫酸铜（CuSO4·5H2O）11.74g，1%次甲基兰7mL，以蒸馏水定容至500mL。

斐林乙液：氢氧化钠（NaOH）126.4g，酒石酸甲钠（C4H4O6KNa·4H2O）117.0g，亚铁氰化钾（K4F4（CN）6·3H2O）9.4g，以蒸馏水定容至500mL。

0.1 %标准葡萄糖（C6H12O6）溶液：准确称取1.00g烘干葡萄糖，溶解并加入5mL盐酸，以蒸馏水定容至1 000mL。

0.7 %标准葡萄糖溶液：准确称取7.00g烘干葡萄糖，溶解并加入5mL盐酸，以蒸馏水定容至1 000mL。

1.2 仪器与设备

SGD-Ⅳ全自动还原糖测定仪：山东省科学院生物研究所；FFLAT18恒温水浴：英国Bibby Scientific公司。1.3实验方法

1.3.1 手工滴定法

①于一试管内加入25.0mL质量浓度20g/L可溶性淀粉溶液，再加5.0mL大曲样液，摇匀，加入20%NaOH溶液1mL后，吸取5.0mL作为空白溶液，用葡萄糖标准溶液滴定，记录其消耗体积V1。

②于另一试管内加入25.0mL质量浓度20g/L可溶性淀粉溶液，再加5.0mL大曲样液，摇匀，置于35℃恒温水浴中，准确计时，糖化1h，加入20%NaOH溶液1mL后，吸取糖化液5.0mL于盛有手工斐林溶液甲、乙液各5.0mL的锥形瓶中，加水10mL，用葡萄糖标准溶液滴定，记录其消耗体积V2。

③结果计算

试样的糖化力以下公式计算：

式中：X为试样的糖化力，mg/（g·h）；V1为滴定空白时，消耗葡萄糖标准溶液的体积，mL；V2为滴定试样时，消耗葡萄糖标准溶液的体积，mL；2.5为每毫升葡萄糖标准溶液中含有葡萄糖的质量，mg；30为糖化混合液（可溶性淀粉溶液加大曲样液）的总体积，mL；0.25为5mL大曲样液相当大曲的质量，g；5为滴定时吸取的糖化液体积，mL。

1.3.2 还原糖仪器分析方法[11，14]

①SGD-Ⅳ全自动还原糖测定仪-根据大曲酶活力测定区间对山东省科学院生物研究所的软件及采样程序进行调整。

②标定

按“开/关”键，自动启动程序。仪器自动进行空白对照测定，完成对照测定后自动进入定标程序，试剂泵启动后，用移液器将5.00mL 0.1%标准葡萄糖溶液标准品注入反应池，完成后仪器自动定标。

③测定

a）空白测定方法

于一试管内加入25.0mL质量浓度20g/L可溶性淀粉溶液，再加5.0mL大曲样液，摇匀，加入20%NaOH溶液1mL后，吸取5.0mL作为空白溶液，用全自动还原糖测定仪测定，记录还原糖测定值G空白（g/L）。

或者吸取5.0mL质量浓度20g/L可溶性淀粉溶液用全自动还原糖测定仪测定，记录还原糖测定值G淀粉空白（g/L）；同时吸取5.0mL大曲样液用全自动还原糖测定仪测定，记录还原糖测定值G酶液空白（g/L）。

b）糖化试样测定方法

于另一试管内加入25.0mL可溶性淀粉溶液，再加5.0mL大曲样液，摇匀，置于35℃恒温水浴中，准确计时，糖化1h，加入20%NaOH溶液1mL后，吸取糖化液1.00mL，加蒸馏水4.00mL，用全自动还原糖测定仪测定，记录测定值G测定（g/L）。

c）糖化力计算

大曲的糖化力按以下公式计算：

式中：X为试样糖化力，mg/（g·h）；5为进样量稀释倍数；120为糖化力转换系数。

2 结果与分析

2.1 精确度试验

采用手工滴定法和还原糖测定仪仪器分析法同时测定4种酒曲的糖化力，每个样品进行6次平行测定。测定结果分别见表1～表4。

表1 1#大曲糖化力测定结果Table 1 Saccharifying power of Daqu No.1

表2 2#大曲糖化力测定结果Table 2 Saccharifying power of Daqu No.2

表3 3#大曲糖化力测定结果Table 3 Saccharifying power of Daqu No.3

表4 4#大曲糖化力测定结果Table 4 Saccharifying power of Daqu No.4

由表1～表4可知，手工滴定法测定值波动的较大，手工滴定法变异系数明显高于还原糖仪器分析法。

手工滴定法标准偏差在以上4组测定中相对稳定，标准偏差数值较大，可能与手工滴定法的测定受滴定速度、蒸发量、搅拌速度、加热功率和终点判断等诸多因素影响有关。还原糖测定仪采用补色技术原理进行终点判断消除人为误差影响，同时仪器分析法恒定了滴定速度、蒸发量、搅拌速度、加热功率等影响，测定结果准确度与稳定性明显提高。

2.2 回收率试验

向4#样品糖化完成时添加标准无水葡萄糖0.103 0g样品（相当于增加糖化力412mg/（g·h），用2种方法对加样后样品和未加样样品进行测定，计算加入葡萄糖的回收率，结果见表5。

表5 加标回收率测定结果Table 5 Result of adding standard recovery measurement

由表5可知，手工滴定法回收率为87.9%～116.7%，平均回收率105.6%；还原糖仪器分析法回收率为100.9%～103.7%，平均回收率102.3%；手工滴定法回收率明显波动大，还原糖仪器分析法回收率测定优于手工滴定法。

3 结论

大曲是白酒生产的糖化发酵剂，其质量决定白酒的产量与酒质[15]。大曲糖化力是评价大曲质量的重要生化指标。目前，各大白酒企业大都仍然在使用手工滴定方法测定大曲样品的糖化力，结果往往误差较大，不同的企业测定结果往往无法比较，不能真实准确反映大曲的淀粉酶活性和糖化菌群特点。

还原糖仪器法采用补色光度原理，可以不受样品颜色、浊度干扰，准确测定反应的终点，仪器恒定了滴定反应的温度，滴定速度，搅拌速度，蒸发量等外部条件，因此测定准确度和稳定性较高。另外，仪器法测定全周期2min左右，方便快捷，是一种较好的测定酒曲糖化力的方法。

我国传统的发酵方式，尤其是固体发酵方式，过程检测手段相对落后。不断研究采用先进的仪器分析方法，来逐步取代主观误差较大的传统手工分析方法，提升传统发酵过程检测的技术水平，更好地对传统的以感官经验为基础的固体发酵工艺进行模拟和数字化表征，以提高古老传统工艺科学化、现代化水平。

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Rapid determination of saccharifying power of Daqu

MA Yaohong1,MENG Qingjun1,YANG Yan1,YANG Junhui1,CUI Jinmei2
(1.Shandong Province Key Laboratory of Biosensors,Biology Institute of Shandong Academy of Science,Jinan 250014,China; 2.Shandong Technician Institute,Jinan 250014,China)

Saccharifying power is a key index to measure the Daqu quality.It is very important to analyze saccharifying power of Daqu quickly and rapidly in controlling Daqu quality.A new rapid method for detecting the saccharifying power was established by reducing sugar analyzer.The results showed that the variable coefficient and recovery of saccharifying power were better than manual titration method.It can be used for rapid determination of saccharifying power.

saccharifying power;Daqu;reducing sugar;reducing sugar analyzer

O652.9

A

0254-5071（2014）03-0128-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.031

2014-01-17

国家高技术研究发展计划‘863计划’（2012AA021201）

马耀宏（1970-），男，副研究员，硕士，研究方向生化分析、发酵过程优化与控制。