王建昌，陈志敏，李静，王金凤，姜彦芬，孙晓霞

（河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心，河北石家庄050051）

4种分离培养基检测志贺氏菌效果比较

王建昌，陈志敏，李静，王金凤，姜彦芬，孙晓霞

（河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心，河北石家庄050051）

志贺氏菌是一类具有高度传染性的肠道致病菌。文中基于GB 4789.5—2012《志贺氏菌检验》标准，比较了4种分离培养基检测志贺氏菌的效果。通过4种分离培养基对福氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌的回收率、最低检出限及对不同样品检测效果的比较，对不同培养基的检测效果进行评价。结果显示4种分离培养基最低检出限相近，显色培养基01检测特异性优于其他3种；针对实际检测样品，应灵活选择培养条件，以提高检测的准确性及效率。

福氏志贺氏菌；宋内氏志贺氏菌；显色培养基；检测效果比较

志贺氏菌属是一类革兰氏阴性杆菌，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌[1]，通称痢疾杆菌，为兼性厌氧菌[2]，按照抗原结构和生化反应的不同分为痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae）、福氏志贺氏菌（Shigella flexneri）、鲍氏志贺氏菌（Shigella boydii）和宋内氏志贺氏菌（Shigella sonnei）。在发达国家志贺氏菌感染主要为宋内氏志贺氏菌，而在我国流行菌株则以福氏志贺氏菌为主[3-6]。志贺氏菌引起痢疾的传染源主要为病人和带菌者，主要是通过污染了志贺氏菌的食物、饮水等经口感染，具有十分重要的公共卫生学意义[7]。人类对志贺氏菌感染度极高。在食物卫生检验时，志贺氏菌常作为必检指标之一，因此及时准确的检测手段是预防和控制志贺氏菌传播的关键。

目前食品中志贺氏菌的检测方法主要有常规生化鉴定方法、免疫学方法、分子生物学方法[8-17]，但无论使用何种方法，从检测样品中准确分离到目标菌是确证的关键。鉴于志贺氏菌在进出口食品检测、国内食品日常监测中的重要性，国家卫计委志贺氏菌最新版检测标准由推荐性改为强制性国标GB 4789.5—2012《食品安全国家标准食品微生物学检验志贺氏菌检验》，且在分离培养时增加了显色培养基。显色培养基是一种新型的微生物检测手段，培养基中加入检测目标菌的特征性酶的显色底物，当目标菌在培养基上生长时，其特征性酶就能降解显色底物并产生带有特殊颜色的代谢物，使菌落形成特定的颜色或形态，而干扰菌被抑制或不产生特征性酶而不显色，因而能被有效区别开来。使用显色培养基对致病菌进行检测能节省大量人力、财力和时间，也大大减少假阴性的机会，而且还能对目标菌行定量检测[18]。

本研究选择我国主要流行的志贺氏菌-福氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌，通过实验室常用的3种显色培养基及木糖赖氨酸脱氧胆酸盐（xylose lysine desoxycholate，XLD）培养基对福氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌的回收率、最低检出限，以及对人工污染样品的检测效果进行比较，旨在选择最适合实验室使用的志贺氏菌检测培养基。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

福氏志贺氏菌CICC21678、宋内氏志贺氏菌CICC21679：中国工业微生物菌种保藏管理中心；志贺氏菌增菌肉汤、营养琼脂培养基：北京路桥技术有限责任公司；显色培养基01，由法国公司开发，由显色培养基基础及添加剂配制，志贺氏菌呈白色/清晰菌落，检测时间为20～24h；显色培养基02，由国内生物技术公司开发，由显色培养基基础及显色剂、琼脂配制，志贺氏菌呈白色或无色菌落，检测时间为20～24h；显色培养基03购自国内生物技术公司，由显色培养基基础及添加剂配制，志贺氏菌呈白色/清晰菌落，周围培养基呈红色，检测时间为20～24h；木糖赖氨酸脱氧胆酸盐（XLD）琼脂培养基购自国内生物技术公司，志贺氏菌呈粉红色至无色菌落，检测时间为20h～24h。

羊肉（菌落总数：1.1×105CFU/g；大肠菌群：46 000MPN/100g）、奶粉（菌落总数：1.8×102CFU/g；大肠菌群<30MPN/100g）、果汁（菌落总数<10CFU/g；大肠菌群<30MPN/100g）：市售。

1.2 仪器与设备

DensiCHEK比浊仪：法国梅里埃公司；mini MACS厌氧工作站：英国Don Whitley Scientific公司；SEWARD3500拍击式均质器：英国SEWARD公司；MIR-254-PC低温恒温培养箱：日本Panasonic公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准菌株回收率实验

分别将福氏志贺氏菌CICC21678、宋内氏志贺氏菌CICC21679新鲜培养物用生理盐水稀释至浓度约为1× 108CFU/mL，进行10倍梯度稀释，取10-6、10-7两个梯度菌液各0.5mL，分别涂布营养琼脂培养基（对照）、显色培养基01、显色培养基02、显色培养基03、XLD培养基（试验均做2个平行），37℃，24h培养后观察结果，统计各培养基上生长的菌落总数，计算回收率，分离培养基回收率计算公式：

1.3.2 4种分离培养基最低检出限对比

分别将福氏志贺氏菌CICC21678、宋内氏志贺氏菌CICC21679新鲜培养物稀释到不同浓度，添加到志贺增菌肉汤培养后对4种分离培养基进行最低检出限对比。

1.3.3 人工污染样品的检测

菌液制备：将福氏志贺氏菌CICC21678、宋内氏志贺氏菌CICC21679新鲜培养物制成菌悬液，福氏志贺氏菌分别为102CFU/mL、10CFU/mL；宋内氏志贺氏菌分别为50CFU/mL、5CFU/mL。

样品处理及检测：分别取25g（或25mL）于225mL志贺氏菌增菌肉汤均质袋中，用拍击式均质器连续均质1～2min，液体样品振荡混匀即可。于41.5℃厌氧培养8～20h，相同条件下准备2组平行样。

分离：取增菌液分别划线接种显色培养基01、显色培养基02、显色培养基03、XLD培养基，比较几种选择性分离培养基对志贺氏菌的检出效果。

2 结果与分析

2.1 对志贺氏菌的检出回收率对比

营养琼脂培养基上生长菌落总数理论上为每个分离培养基最多检出的阳性志贺氏菌菌落数。

由表1、表2可看出，显色培养基01对两株志贺氏菌均为回收率最高，说明显色培养基01对志贺氏菌的分离效果好。

表1 福氏志贺氏菌纯菌回收率试验结果Table 1 Recovery rate ofShigella flexneristrains on different medium

表2 宋内氏志贺氏菌纯菌回收率试验结果Table 2 Recovery rate ofShigella sonneistrains on different medium

2.2 4种分离培养基对志贺氏菌最低检出限对比

由表3、表4可知，4种分离培养基对福氏志贺氏菌最低检出限均可达到8CFU/mL，对宋内氏志贺氏菌最低检出限均可达到5CFU/mL。

表3 分离培养基对福氏志贺氏菌的最低检出限Table 3 Minimum detection limits ofShigella flexnerion different medium

表4 分离培养基对宋内氏志贺氏菌的最低检出限Table 4 Minimum detection limits ofShigella sooneion different medium

2.3 人工污染样品检测对比

由表5为福氏志贺氏菌添加，表6为宋内氏志贺氏菌添加。由表5、表6可知，在检测样品中，显色培养基01对福氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌检测效果最好，且高污染样品（羊肉）不同添加浓度在培养8h时，4种培养基均可检出，而在培养20h后只有显色培养基01可检出，其余均无典型菌落生长。中污染（奶粉）、低污染样品（果汁）在不同菌液浓度、不同培养时间无明显差异。

表5 分离培养基检测福氏志贺氏菌人工污染样品结果比较Table 5 Comparison of isolation medium detecting artificially contaminated food withShigella flexneri

表6 分离培养基检测宋内氏志贺氏菌人工污染样品结果比较Table 6 Comparison of isolation medium detecting artificially contaminated food withShigella soonei

在检测样品中，显色培养基01对福氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌检测效果最好，显色培养基03、XLD次之，显色培养基02最差。

高污染样品（羊肉）在添加福氏志贺氏菌时不同浓度时，8h增菌培养后4种培养基均可检出，而在培养20h后只有显色培养基01检出，而其他均被杂菌覆盖，无法检出；在添加宋内氏志贺氏菌高于最低检出限10倍浓度时，8h培养后均可检出，20h后仅显色培养基01和显色培养基03可检出，在添加最低检出限浓度时仅显色培养基01表现出较大优势。中污染（奶粉）样品在8h检测时2种志贺氏菌有个别无检出，而20h培养后均可检出。低污染（果汁）样品在不同浓度不同培养时间均可检出2种志贺氏菌，4种培养基之间无差异。本实验结果表明在背景污染较重的样品检测时应在8h、20h分别接种划线分离（可几种培养基同时联合使用）以防止漏检，而中污染、低污染样品在20h培养后划线分离即可。

3 结论

通过以上实验结果可以看出，4种分离培养基对目标菌和非目标菌的生长和选择均能达到基本性能要求，且不同浓度志贺氏菌在不同培养基上回收率不同以及不同食品种类、污染程度、增菌培养时间都对检出效果有一定影响。志贺氏菌显色培养基01在本研究中表现出较大的优势，为检测效率和准确度提供了保障。但是显色培养基01在使用过程中也存在一些假阳性的问题，例如恶臭假单胞菌单从菌落形态上很难和志贺氏菌在显色培养基01上进行区分，需要进行进一步的初步生化确证实验。

使用方便、灵敏高效的显色培养基成品及试剂盒将是微生物快速检测新技术最有潜力的方向之一，但是显色培养基在检测食品样品会遇到更多的挑战，不仅干扰菌的种类更多更复杂，而且食品的成分和添加剂更可能影响显色培养基的检测特性。使用显色培养基进行致病菌检测时，应该充分考虑样品污染背景，选择合适的增菌时间，从而避免漏检和假阴性检测结果的出现。

[1]王叔淳.食品卫生检验技术手册[M].北京：化学工业出版社，2002.

[2]SHAKOOR S,ZAIDI A,HASAN R.Tropical bacterial gastrointestinal infections[J].Infect Dis Clin N Am,2012,26(2):437-453.

[3]王晓萌，有田世乃，增田志高，等.肠道致病菌暴发事件中分子分型技术的应用[J].中华预防医学杂志，2006，40（2）：39-42.

[4]蒋鸿超，黄海林，苏敏，等.小儿细菌性痢疾147例志贺菌菌型及耐药性分析[J].儿科药学杂志，2013，19（2）：43-46.

[5]邱亚群，林一曼，张倩，等.深圳市食品、公共场所从业人员志贺氏菌属带菌情况分析[J].实用预防医学，2004，11（2）：175-176.

[6]康燕明.怒江州2006-2010年志贺氏菌菌型分布及耐药性变迁分析[J].中国卫生产业，2012，34：136.

[7]严睿，朱凤才.志贺菌分子生物学检测技术研究进展[J].中国病原生物学杂志，2008，3（6）：464-467.

[8]中国疾病预防控制中心营养与食品安全所.GB/T4789.5—2012.食品微生物学检验志贺氏菌检验[S].北京：中国标准出版社，2012.

[9]钟青萍，葛萃萃，张世伟，等.检测食品中志贺氏菌的双抗夹心ELISA方法的研究[J].食品科技分析检测，2007，32（10）：199-202.

[10]秦巧玲.志贺氏菌多克隆抗体制备及ELISA检测方法的建立[D].武汉：华中农业大学硕士论文，2008.

[11]李君文，晁福寰，靳连群，等.基因芯片技术快速检测水中常见致病菌[J].中华预防医学杂志，2002，36（4）：238.

[12]BARLETTA F,LIU Q A,CLEARY T,et al.Detection ofCampylobacterspp,Salmonellaspp,andShigellaspp.enteropathogens by real-time multiplex PCR[J].Trop Medi Int Health，2011,16:255-256.

[13]吴平芳，石晓路，郑琳琳，等.改良分子信标-实时PCR快速检测志贺氏菌[J].中国卫生检验杂志，2006，16（4）：394-395，468.

[14]刘成志，钱凯，李洁莉，等.乳饮料中志贺氏菌的快速PCR检测技术研究[J].江苏食品与发酵，2009（1）：1-5.

[15]徐锋，武晓丽，徐迪，等.牛奶样品中志贺氏菌胶体金免疫试纸条检测方法的建立[J].中国乳品工业，2012，40（5）：40-50.

[16]赵丽华，周勇，万成松.分子信标PCR检测志贺菌ipaH基因[J].热带医学杂志，2006，6（5）：499-502.

[17]甘莉萍，刘渠，陈应坚，等.荧光定量PCR和DNA分子分型在菌痢暴发中的应用[J].现代预防医学，2007，34（5）：937-938，941.

[18]SILVA B O,CARAVIELLO D Z,RODRIGUES A C,et al.Evaluation of Petrifilm for the isolation ofStaphylococcus aureusfrom milk samples[J].J Dairy Sci,2005,88(8):3000-3008.

Comparison of theShigella detection effect with four common culture media

WANG Jianchang,CHEN Zhimin,LI Jing,WANG Jinfeng,JIANG Yanfen,SUN Xiaoxia
(Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Technical Center,Shijiazhuang 050051,China)

Shigellais a common pathogenic species with highly contagious.Based on the national standard of GB 4789.5—2012,comparison among the detection effects of four common culture medium for isolatingShigellawas made.Through the comparison of four isolation medium forShigella flexneriandShigella sooneion recovery rate,limit of detection and detection effect,the detection effect of four media were evaluated.The results showed that the four media had the similar minimum detection limits,and the Chromogenic media 01 demonstrated better specificity in isolation than the other three.The pathogen isolation and culture conditions should be determined and chosen flexibly based on the property of the sample,in order to improve the accuracy and efficiency of detection.

Shigella flexneri;Shigella soonei;chromogenic media;detection effect comparison

R378.2

A

0254-5071（2014）03-0113-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.027

2014-01-05

国家级质检公益行业科研专项项目（201210128）

王建昌（1981-），男，博士，主要从事食品微生物、进出境动物及动物产品检测工作。