程振玉，杨英杰*，刘治刚

（1.吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林吉林132022；2.东北师范大学化学学院，吉林长春130024）

超声波辅助酶法提取北五味子多糖工艺研究

程振玉1，2，杨英杰1*，刘治刚1

（1.吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林吉林132022；2.东北师范大学化学学院，吉林长春130024）

建立了超声波辅助复合酶（纤维素酶/蛋白酶/果胶酶=1∶1∶1）提取北五味子多糖的方法。以多糖的提取率为研究指标，通过设计正交试验和响应面优化试验，对超声波辅助复合酶法提取北五味子多糖的工艺进行了优化。确定最佳工艺条件为酶解温度45℃，缓冲液pH 4.6，复合酶用量2%，酶解时间为2.0h，超声波功率166W，萃取温度56℃，萃取时间39 min。在此最佳条件下，北五味子多糖提取量达到105.36mg/g。超声波辅助复合酶法应用到多糖的提取领域，节省了时间，降低了溶剂消耗，且明显提高了多糖的提取率，该法操作方便，简单易行，为北五味子多糖工业化生产提取提供了理论依据。

北五味子；多糖；复合酶；超声波；提取

北五味子[Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.]为木兰科多年生落叶藤本植物五味子的干燥成熟果实，是著名的滋补性中药，被列为上品，最早记录在《神农本草经》中，其应用已经有两千多年的历史[1-2]。现代药理研究表明，北五味子主要活性成分多糖具有保肝、抗疲劳、抗氧化、抗肿瘤、免疫促进等重要作用[3-5]。因此，对五味子多糖的提取工艺进行系统考察，使多糖的提取率显著提高，对扩大其应用和工业化生产具有现实意义[6]。传统方法中多糖的提取主要采用回流法[6-7]，该法耗费时间长，所需温度高，能源耗费大，提取率低，且长时间的高温极易导致多糖的降解，影响其药理活性[8]。

近年来酶技术因其提取条件温和，破坏细胞壁能力强，易水解植物中的胶质、蛋白，能充分释放细胞内活性成分等特点已广泛应用于植物中有效成分的提取[9-11]，超声波技术具有节省溶剂、提取时间短，操作简单，提取效率高等特点亦成为现代天然药物萃取的新方法[12-13]。因此本研究通过响应面优化试验和正交试验的设计，对复合酶-超声波结合提取多糖的可行性及其工艺进行了研究，以期显著提高北五味子多糖的提取率，使北五味子药用资源得到充分的利用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

无水乙醇、石油醚、浓硫酸、盐酸、苯酚、氢氧化钠、柠檬酸均为分析纯：天津市永大化学试剂有限公司；葡萄糖：中国药品生物制品鉴定所，批号100503-200702；木瓜蛋白酶（活力50 000U/g）：北京奥博星生物技术有限责任公司；果胶酶（20 000U/g）、纤维素酶（活力15 000U/g）：上海蓝季科技发展有限公司；五味子购买于吉林省通化市，产地为长白山地区，经过吉林化工学院环境与生物工程学院隋新副教授鉴定为北五味子（Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.）的干燥果实。

1.2 仪器与设备

722可见分光光度计：上海欣茂仪器有限公司；RE-52A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；SY-800超声波清洗器：上海宁商超声仪器有限公司；ZNCL-G智能恒温磁力搅拌器：上海长城仪器科技有限公司；SHZ-D循环水式真空泵：河南省巩义市英峪仪器一厂；Allegra 64R（BACKMAN）离心机、RT-08多功能粉碎机：荣聪精密科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 药材的预处理

取50℃干燥24h的北五味子，粉碎，过60目筛。准确称取500.0g，置于索氏提取器中，加入一定量石油醚（60～90℃）脱脂，然后加入体积分数为80%的乙醇回流除去色素、单糖、低聚糖和一些小分子物质[7]。抽滤，除去滤液，得到预处理的北五味子。

1.3.2 酶法提取多糖工艺优化正交试验优化设计

根据已经报道的酶法提取植物多糖的文献[10，14]，选择纤维素酶/蛋白酶/果胶酶=1∶1∶1作为复合酶。精确称量预处理的五味子5.0g，加入一定量的复合酶，置于盛有100mL柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲溶液的圆底烧瓶中。调整缓冲液到一定pH值，将烧瓶置于智能恒温磁力搅拌器中，在一定温度条件下600r/min酶解一段时间。提取结束后，提取液离心，药渣及烧瓶用少量蒸馏水洗涤后，继续离心，合并2次所得上清液，用旋转蒸发仪浓缩到原体积的1/5，加入无水乙醇至体积分数达到80%。4℃静置过夜，离心，收集沉淀，用无水乙醇洗涤3次，冷冻干燥得五味子粗多糖。在对单因素考察的基础上，选用L9（34）正交试验设计，以多糖提取量作为考察指标，对酶解温度，酶解时间，缓冲液pH和酶用量4个因素进行正交试验，因素与水平见表1。

表1 酶解条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal test for hydrolysis condition optimization

1.3.3 超声波辅助酶法提取多糖响应面优化试验设计

根据正交试验确定多糖的最优提取条件，用复合酶提取多糖。酶法提取完成后，取出烧瓶，将其浸没于盛有水的超声波清洗器中辅助提取，以一定的功率在一定的温度条件下萃取一段时间。萃取完成后，按照1.3.2项所述方法处理提取液，得北五味子粗多糖。根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理，在单因素的基础上，选取对提取量影响比较大的3个因素（超声功率、萃取温度、萃取时间）进行优化，采用3因素3水平的响应面分析方法，确定超声波辅助酶法提取多糖的最佳工艺参数。试验设计见表2。

表2 试验因素水平编码Table 2 Factors and levels of response surface methodology

1.3.4 多糖含量的测定

老人对呼伦说，我还以为这本书你用不着了。呼伦说那您也不能随便往外借家里的东西啊！老人说可是他参观完你的书房以后硬要借走这本书……说他家里也有几枚老古钱，想对着书看一下能不能挑出几个值钱的。呼伦说您还带别人参观书房？老人挠挠头皮说，不可以吗？呼伦叹一口气，说，那这样吧，明天您再帮我把书要回来……不是我想难为您，妈，如果是别的书也就罢了，可是我还得靠这本书写我的稿子呢。老人想了想，说，可是我不知道他叫什么。

以多糖提取量作为研究指标，用葡萄糖作为标准物，采用苯酚-硫酸法[15]，于恒温25℃条件下在波长490nm处测吸光度值，以吸光度值A（y）为纵坐标，葡萄糖质量浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

葡萄糖标准曲线见图1。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

由图1可知，标准曲线的线性回归方程y=0.0099x-0.017 9，相关系数R2=0.999 7，在10～70μg/mL范围内葡萄糖含量与吸光度值呈良好的线性关系，可用于多糖含量的准确分析。

2.2 酶法提取多糖工艺优化的正交试验结果分析

酶法提取多糖工艺优化正交试验结果与分析见表3，正交试验结果方差分析见表4。

由表3可知，在复合酶提取多糖的工艺中，4个因素的影响顺序依次为：缓冲液pH（B）>酶解时间（D）>酶解温度（A）>酶用量（C），复合酶法提取北五味子多糖的最佳工艺条件组合是A1B3C3D2，即酶解温度45℃，缓冲液pH值为4.6，复合酶用量为2%，酶解时间2.0h。在此最佳条件下进行验证试验，多糖提取量为85.16mg/g。

表3 酶解条件优化正交试验结果Table 3 Result of orthogonal test for hydrolysis condition optimization

表4 正交试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal test for hydrolysis condition optimization

由表4可知，在影响复合酶提取多糖的因素中，缓冲溶液的pH影响极显著，酶解时间有一定的影响，酶解温度、酶用量几乎没有影响，与极差分析的结果吻合，验证了极差分析结果的准确性。

2.3 超声波辅助酶法提取多糖响应面结果分析

2.3.1 模型的建立及显著性检验

利用Design-Expert 8.0软件设计响应面优化试验，试验结果见表5，对其数据进行二次多项式逐步回归拟合，回归方程如下：

模型的可靠性可从方差分析及相关系数来考察。由表6可知，该模型的F=28.75，P=0.000 1，证明该试验所选用的二次多项模型极其显著。在总的影响因素中，B、C、B2、C2项（P<0.05）对多糖的提取有极显著的影响；而方程的交互项的P>0.05，表明其对五味子多糖的提取影响不显著，各具体因子对响应值的影响不是简单的线性关系，各因子间的交互作用影响不显著，可忽略。失拟项F=1.36，P> 0.05，说明无显著性影响，数据中没有异常点，模型适当，不需要引入更高次数的项；回归方程的相关系数R2=97.37%表明本试验只有2.63%的数据不能用该模型来解释，相关系数R2=97.37%与决定系数R2adj=93.98%相差不大，说明回归方程拟合度高，该模型能很好地描述试验结果，可以用来准确分析和预测北五味子多糖的提取结果。

表5 响应面试验设计及结果Table 5 Design and result of Box-Behnken

表6 回归模型的方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

2.3.2 提取工艺的响应曲面分析与优化

为了更直观地表现2个因素对多糖提取量的影响，可以把超声功率、温度、萃取时间3个因素中1个因素取零水平，另2个因素对多糖提取量的影响进行分析，图2直观地反映了因素间的交互作用对响应值的影响。

图2 各因素交互作用对影响多糖提取量的响应面图Fig.2 Response surfaces plot and contour plot of interaction among each two factors of temperature,time and power on polysaccharide extraction yield

由图2可知，温度和时间对多糖的提取量影响非常显著，表现为曲线较陡，响应值变化较大；超声功率对多糖的提取量影响较小，表现为曲线较为平缓，其数值的增加或减少，响应值变化都很小。

由Design-Expert软件对试验参数进一步优化，可以得出最优条件为超声功率165.41W，萃取温度55.96℃，萃取时间38.74min，在此条件下北五味子多糖的提取量可达到107.84mg/g。

2.4 最佳试验条件的结果验证

准确称取前处理北五味子5.0g，按照正交试验所确定的最佳条件，首先用复合酶提取北五味子多糖，然后根据响应面优化试验所确定的最佳工艺，超声波法辅助提取。根据实际操作的可行性，试验将超声波的工艺参数调整为超声功率166W，提取温度56℃，提取时间39min。在此工艺条件下，重复试验3次，五味子多糖提取量为105.36mg/g，与响应面预测值基本吻合，表明该方法能很好的提取北五味子多糖。

2.5 不同方法提取多糖的比较

根据本试验所优化的工艺条件，采用酶法和超声波法分别直接提取北五味子多糖。酶法提取工艺为：称取预处理的北五味子5.0g，加入2%的复合酶后，浸没于100mL pH为4.6的柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲溶液，在45℃的恒温智能恒温磁力搅拌器中以600r/min的转速搅拌2.0h，在此条件下，多糖的提取量为90.13mg/g；超声波提取工艺为：称取预处理的北五味子5.0g，加入100mL蒸馏水，以166W的功率在56℃提取39min，在此条件下，多糖的提取量为79.21mg/g；回流法根据文献[16]报道的最佳提取条件，称取预处理的北五味子5.0g，加入150mL蒸馏水，于90℃水浴中回流提取2h，提取3次，在此条件下，多糖提取量为84.79mg/g。本实验所建立的超声波辅助复合酶法，北五味子多糖的提取量最高，达到105.36mg/g。酶解破坏细胞壁能力强，超声波辅助时间短，多糖提取量明显提高，弥补了单一的酶法和超声波分别提取活性成分的不足。与传统回流法相比，时间更是显著缩短，节约了资源，提高了效率。

3 结论

建立了超声波辅助复合酶萃取北五味子多糖的方法。通过设计正交试验和响应面优化试验，确定了该法最优工艺参数为酶解温度45℃，缓冲液pH 4.6，复合酶用量2%，酶解时间为2.0h，超声波功率166W，萃取温度56℃，萃取时间39min。在此最佳条件下，北五味子多糖提取量达到105. 36mg/g。此法多糖提取量明显高于回流法、酶法和超声波法，原因可能是药材经过复合酶处理，细胞破壁能力增强，在后续的超声波萃取过程中，溶剂分子对药材基体的渗透和待提取成分的溶剂化被进一步加速，从而使活性成分的提取量得以显著提高。超声波辅助酶法萃取北五味子多糖所需时间短，能耗低且显著提高了多糖的提取量，为工业化大量生产北五味子多糖提供了数据支撑和理论依据。

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Technology of ultrasonic-assisted enzyme extraction of polysaccharide fromSchisandra chinensis

CHENG Zhenyu1,2,YANG Yingjie1*,LIU Zhigang1
(1.College of Chemical&Pharmaceutical Engineering,Jilin Institute of Chemical Technology,Jilin 132022,China; 2.School of Chemistry,Northeast Normal University,Changchun 130024,China)

The method of ultrasonic-assisted enzymatic extraction(cellulase:papain:pectinase was 1∶1∶1)of polysaccharide fromSchisandra chinensis was established.Orthogonal test and response surface methodology and was employed to optimize the technology conditions for extracting polysaccharide fromS.chinensis,taking polysaccharide extraction yield as evaluation index.The optimum extraction parameters of polysaccharides for ultrasonic-assisted enzyme were obtained as follows:hydrolysis temperature 45℃,buffer solution pH 4.6,compound enzyme 2%,hydrolysis time 2.0 h, ultrasonic power 166 W,extraction temperature 56℃,and extraction time 39 min.Under the optimal condition,the extraction yield of polysaccharides was 105.36 mg/g.The approach proposed in this study shortened extraction time,reduced solvent consumption,improved the extraction yield of polysaccharides.The method was easy and simple,providing theoretical basis for polysaccharide extraction fromS.chinensis.

Schisandra chinensis;polysaccharide;compound enzyme;ultrasonic;extraction

R284.2

A

0254-5071（2014）03-0104-05

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.025

2014-01-16

程振玉（1986-），男，硕士研究生，研究方向为天然产物化学。

*通讯作者：杨英杰（1955-），男，教授，本科，研究方向为天然药物化学。