鲍帅帅，张默，王新平，陈雄，陈守文，李俊辉，李冬生，王志*

（1.湖北工业大学生物工程学院，湖北武汉430068；2.华中农业大学绿康生物工程研究所，湖北武汉430070；3.绿康生化股份有限公司，福建浦城353400）

谷氨酸对地衣芽孢杆菌产杆菌肽的影响

鲍帅帅1，张默1，王新平1，陈雄1，陈守文2，李俊辉3，李冬生1，王志1*

（1.湖北工业大学生物工程学院，湖北武汉430068；2.华中农业大学绿康生物工程研究所，湖北武汉430070；3.绿康生化股份有限公司，福建浦城353400）

研究了发酵过程中添加谷氨酸对菌体代谢和杆菌肽合成的影响。摇瓶发酵过程中添加0.03g/L谷氨酸，杆菌肽产量增加13.4%，而10L发酵罐发酵16h添加0.03g/L谷氨酸，杆菌肽效价在36h达到峰值。发酵16～26h以3mg/（L·h）流加谷氨酸，杆菌肽16～34h的合成速率是34.0U/（mL·h），比对照组提高55.3%；同时，生物量16～30h增长速率是20.2μg/（mL·h），比对照组提高了17.4%，但是菌体自溶时间比对照提前了6h。NO2-浓度在18～32h高于对照组11.4%～154.9%，挥发性脂肪酸（VFA）浓度在22～32h低于对照组10.3%～94.8%。说明流加谷氨酸起到了调控因子的作用，通过生成NO2-增加了NADH的消耗，降低了VFA的生成，刺激了菌体在发酵中前期的生长；谷氨酸同时也参与到了杆菌肽的合成，加快了杆菌肽的积累。

地衣芽孢杆菌；杆菌肽；谷氨酸；生长因子；合成前体

杆菌肽是由一些地衣芽胞杆菌和枯草芽孢杆菌菌株产生的多肽类抗生素，并被国内外广泛用作饲料添加剂[1]。杆菌肽分子是由谷氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等12个氨基酸组成的含有噻唑环的多肽复合体[2]。因此，氨基酸的代谢在杆菌肽的生物合成中起着重要作用，如Lys、Asn、Phe、Ile、Leu、Asp、Cys等对生长有明显的促进作用[3]。而谷氨酸、谷氨酰胺又是细胞氮代谢的重要中转站，发酵过程中添加的外源谷氨酸，可以促进鸟氨酸等氨基酸的合成过程[4]、增加谷氨酰胺供量以增加细胞代谢所需氮的供给[5]以及为杆菌肽合成提供前体[6]。

另外，由于地衣芽孢杆菌浊液发酵产杆菌肽细胞浓度高、发酵液黏稠，造成了细菌在发酵中后期处于缺氧的环境[7]。而地衣芽孢杆菌是典型的兼性厌氧菌，细胞为了平衡NADH/NAD+，可通过生成丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）[8]来消耗NADH。另外，地衣芽孢杆菌具有同化型硝酸盐还原系统（将NO3-还原生成NO2-并生成NH4+）[9]，可以通过硝酸盐呼吸消耗NADH[10]。VFA和NO2-的浓度变化可以反映细胞的氧化还原状态。

本实验研究了谷氨酸的添加对氧限制条件下地衣芽孢杆菌生长、代谢以及杆菌肽合成的影响。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 培养基

（1）种子斜面培养基：蛋白胨5g/L，牛肉提取物3g/L，酵母抽提物2g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L，37℃培养24h。

（2）发酵培养基：大豆粉50g/L，淀粉40g/L，碳酸钙4g/L，硫酸铵0.7g/L，蛋白胨10g/L。

1.1.2 菌种来源

地衣芽孢杆菌LC-11（Bacillus licheniformisLC-11）由华中农业大学绿康生物工程研究所提供。

1.2 仪器与设备

SPX-150D型恒温生化培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；UV-722型紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司分析仪器总厂；TGL-20台式高速离心机：武汉中科科仪技术发展有限责任公司；1200高效液相色谱：美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 培养方法

10L罐培养：装料5L，接种量10%（v/v），空气流量600L/h，转速300r/min，37℃培养42h左右。

1.3.2 样品处理方法

发酵过程中，周期取10mL发酵液，液氮冻存。解冻后在10 000r/min、4℃条件下离心30min，上清液用于代谢物检测。

1.3.3 杆菌肽的检测

取预处理后的上清液1mL，加入体积分数50%乙醇4mL，振荡3min摇匀，再10 000r/min离心5min，取上清液0.22μm过滤，滤液用于高效液相色谱法检测杆菌肽的含量[11]。

1.3.4 NO2-的测定方法

在弱酸条件下，亚硝酸根离子与对氨基苯磺酸重氮化合物反应，产物与盐酸萘乙二胺偶合生成紫红色的重氮化合物，采用分光光度法测定NO2-的浓度[12]。

1.3.5 生物量的测定

采用二苯胺法测定培养液中DNA的含量[13]，用DNA的含量表征生物量。

1.3.6 VFA的测定方法

挥发性脂肪酸与乙二醇在加热条件下反应生成酯，生成的酯再与羟胺反应生成氧肟酸，在高铁试剂存在的条件下氧肟酸与高铁离子反应形成棕红色的络合物。利用此颜色反应可以测定挥发酸的含量[14]。

2 结果与分析

2.1 摇瓶培养20h添加谷氨酸对杆菌肽合成的影响

图1 摇瓶培养20h添加谷氨酸对杆菌肽效价的影响Fig.1 Effect of glutamic acid addition at 20h on bacitracin production in shake flasks

在摇瓶发酵20h时分别添加终浓度0.01g/L、0.03g/L、0.05g/L、0.07g/L的谷氨酸，发酵48h后检测发酵液的效价如图1所示。添加不同浓度的谷氨酸都对杆菌肽的合成起到了促进作用，谷氨酸添加量为0.03g/L时杆菌肽效价达到759U/mL，比对照提高了13.4%，说明适量添加谷氨酸能够有效提高地衣芽孢杆菌产杆菌肽的效率。

2.2 10L罐发酵16h添加谷氨酸（0.03g/L）对生长和杆菌肽合成的影响

图2 10L罐培养16h添加0.03g/L谷氨酸对杆菌肽产量的影响Fig.2 Effect of glutamic acid addition(0.03g/L)on bacitracin production in a 10L bioreactor cultivated for 16h

由于杆菌肽在摇瓶和发酵罐发酵的周期不同，通过摇瓶发酵的添加时间占总发酵时间的比例换算（摇瓶添加时间×发酵罐发酵总时间/摇瓶发酵时间）确定在16h向罐中补加谷氨酸。如图2所示：添加组杆菌肽效价在发酵36h达到最大856U/mL，并且随时间延长生物量（以DNA含量表示）开始减少；而对照组效价38h达到最大值923U/mL，且生物量开始减少。虽然发酵效价达到最高峰的时间缩短了2h，但是添加组杆菌肽效价却较对照降低了7.3%。而且添加对细胞的后期生物量产生了抑制作用，其生物量在34～38h低于对照2.8%～30.9%，而且38h开始急剧下降，40h比对照降低了30.9%。说明一次性添加谷氨酸对菌体生长和代谢干扰大，后期生物量明显低于对照，而且菌体自溶时间比对照提前了2h。因此，采用连续流加的方式考察谷氨酸对细胞生长、代谢和杆菌肽合成的影响。

2.3 10L罐16h流加谷氨酸对杆菌肽合成的影响

图3 10L罐培养16～26h过程中以3mg/（L·h）的速率流加谷氨酸对杆菌肽产量和生物量的影响Fig.3 Effect of glutamic acid addition from 16h to 26h at the rate of 3mg/（L·h）on bacitracin production and biomass in a 10L bioreactor

由图3可知，从16h开始以3mg/（L·h）速率流加谷氨酸（总量不变，流加10h），杆菌肽的合成速率（16～34h）是34.0U/（mL·h），比对照21.9U/（mL·h）显著提高55.3%，效价高点（34h）比对照（38h）提前了4h。添加组生物量的增长速率（16～30h）是20.2μg/（mL·h），比对照组的17.2μg/（mL·h）提高了17.4%，并在30h开始自溶，比对照提前了6h。说明流加的谷氨酸既刺激了菌体在发酵中前期的生长，也参与到了杆菌肽的合成，加快了杆菌肽的积累，且杆菌肽效价到了1 020U/mL，比对照提高9.6%。

2.4 10L罐发酵过程VFA和NO2-的变化规律

图4 10L罐培养过程中以0.3mg/（L·h）的速率流加谷氨酸10h对VFA和NO2-(平均值±标准偏差)的影响Fig.4 Effect of training process with glutamic acid addition rate of 0.3mg/（L·h）for 10h on VFA and NO2-with standard deviation in a 10L fermenter

10L罐发酵过程中VFA和NO2-的变化如图4所示，对照组和添加组的NO2-浓度变化情况基本相同，分别在14h达到最高浓度52.5mmol/L和54.2mmol/L，并在18h分别降至最低值6.67mmol/L和7.43mmol/L，之后回升。这可能是由于菌体在发酵前期快速生长（图3），导致培养系统中的菌体处于缺氧状态，地衣芽孢杆菌的硝酸盐呼吸代谢启动，使NO2-浓度迅速提高，后随着NO2-的进一步代谢而快速降低。18h后，NO2-浓度变化出现显著差异，18～34h，添加组的NO2-浓度是7.43～34.69mmol/L，显著高于对照11.4%～154.9%。同时，22～34h，添加组的VFA是0.25～4.53g/L，低于对照10.3%～94.8%，说明细胞通过硝酸盐呼吸代谢消耗了NADH，减少了小分子挥发酸的生成[5]。18h后NO2-迅速积累，说明谷氨酸起到了调控因子的作用，促进了硝酸根的还原、增加了NADH的消耗，分流了细胞通过产生VFA所消耗的NADH，导致添加组的VFA的水平远低于对照组的水平[15]。

3 结论

在利用地衣芽胞杆菌发酵产杆菌肽的过程中，16～26h以3mg/（L·h）流加谷氨酸可以有效提高杆菌肽的产量，放罐效价达到1 020U/mL，且缩短了发酵周期约4h。实验结果显示，谷氨酸还促进了硝酸还原酶的活性，提高细菌在缺氧条件下的生存能力。至于谷氨酸是如何提高硝酸还原酶的活性的，还有待进一步研究。

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Effect of glutamate addition on bacitracin production byBacillus licheniformis

BAO Shuaishuai1,ZHANG Mo1,WANG Xinping1,CHEN Xiong1,CHEN Shouwen2,LI Junhui3,LI Dongsheng1,WANG Zhi1*
(1.College of Biotechnology,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China; 2.Lifecome Bioengineering Institute of Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China; 3.Lifecome Biochemistry Co.,Ltd.,Pucheng 353400,China)

Effect of glutamate addition on bacteria metabolism and bacitracin synthesis during fermentation was studied.The bacitracin production increased 13.4%after adding 0.03 g/L glutamate acid into shaker flask during fermentation.The fermentation in 10 L bioreactor was conducted, 0.03 g/L glutamic acid was added into the bioreactor at the 16 h of fermentation,and the bacitracin titer reached the highest at the 36 h.During the 16-26 h of fermentation,glutamic acid was added at the rate of 3 mg/ml,the synthetic rate of bacitracin in 16-34 h was 34.0 U/(ml·h),increased 55.3% than the control group.Meanwhile,the increase rate of biomass was 20.2 μg/(ml·h),increased 17.4%than the control group,but the autolyzed time decreased 6 h.NO2-content was 11.4%to 154.9%higher than the control group from 18 h to 32 h.However,the volatile fatty acids content from 18 h to 32 h was 10.3%-94.8%lower than the control group from 22 h to 32 h.The results suggested that glutamic acid played an important role in regulating factors;it enhanced the NADH oxidation efficiency through NO2-synthesis,reduced the volatile fatty acids production,stimulated cell growth and favored bacitracin production in the end.

Bacillus licheniformis;bacitracin;glutamate acid;growth factor;synthesis precursor

TQ465

A

0254-5071（2014）03-0049-03

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.013

2014-01-21

华中农业大学绿康生物工程研究所科技攻关项目（2011090121）

鲍帅帅（1989-），男，硕士研究生，主要从事发酵工程的研究工作。

*通讯作者：王志（1971-），男，副教授，博士，主要从事代谢工程的研究工作。