刘郁鹏，朱烨菁，陈 橼，钱 俊，黄向华，周晓梅，刘玉山，张一心，施民新，毛清华（南通市肿瘤医院外科，江苏66；南通大学医学院；南通市肿瘤医院病理科）

新辅助化疗对相关肺癌基因Bcl-2和Beclin-1表达影响

刘郁鹏1*，朱烨菁2，陈 橼1，钱 俊2，黄向华1，周晓梅1，刘玉山3，张一心1，施民新1，毛清华1
（1南通市肿瘤医院外科，江苏226361；2南通大学医学院；3南通市肿瘤医院病理科）

目的：探讨Ⅱ～Ⅲ期肺腺癌（lung adenocarcinoma）患者体内Bcl-2和Beclin-1基因、蛋白表达与新辅助化疗间关系。方法：经免疫组织化学法检测Ⅱ～Ⅲ期肺腺癌80例患者组织中Bcl-2和Beclin-1蛋白表达水平，利用实时定量聚合酶链反应法检测治疗后Ⅱ～Ⅲ期肺腺癌患者组织中Bcl-2和Beclin-1基因表达水平，并研究2种基因表达与新辅助化疗疗效间关系。结果：治疗前两组之间Bcl-2和Beclin-1的蛋白表达水平差异无统计学意义，且Beclin 1与Bcl-2在肺腺癌中表达呈负相关，其相关性具有统计学意义（r=-0.43，P<0.01）。实时定量聚合酶链反应法检测结果显示经新辅助化疗后，化疗组Beclin-1mRNA水平明显高于对照组，而Bcl-2水平明显低于对照组，治疗前恰恰相反，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：利用新辅助顺铂和多西他赛方案术前化疗，可影响肺腺癌组织中Bcl-2和Beclin-1的表达水平，为研究抑制Bcl-2的表达提高临床参考。

肺腺癌；新辅助化疗；Bcl-2；Beclin-1；实时定量聚合酶链反应；免疫组织化学法

1 资料与方法

1.1 一般资料 收治II-IIIA期肺腺癌患者80例分为两组，（1）化疗组∶接受新辅助化疗且成功手术切除患者40例，年龄47～75岁，平均62.9岁，均经病理组织学证实的肺腺癌。（2）对照组∶为同期住院直接手术切除肺腺癌患者40例，患者在术前均未经任何放化疗和免疫治疗。2组一般资料比较差异无统计学意义（表1）。入选标准∶（1）术前CT引导下经穿刺空芯针活检，经组织学或细胞学检查证实为肺腺癌；（2）术前未接受任何其他抗肿瘤治疗；（3）术前评估∶对可切除的II～III期肺腺癌患者且无化疗禁忌证，其中术前新辅助化疗方案选用DP方案“顺铂（40mg/m2d1，2，3）和多西他赛（120mg/m2d1）的化疗方案”进行2个周期术前新辅助化疗。手术在化疗结束后4周进行，按照NCCN指南行术前辅助性化疗。治疗前均经患者和家属充分知情同意，并签署化疗知情同意书。（4）根治性手术切除即肿瘤所在肺叶切除；（5）术后病理确诊为肺腺癌及pTNM分期。所有入组患者未合并其他恶性肿瘤及严重内科疾病，从未接受过放化疗及手术治疗，一般状况良好。均收集患者术前活检蜡块及手术切除的新鲜冰冻组织。

表1 术前化疗组和对照组患者不同临床参数关系

1.2 材料和试剂 兔抗人Bcl-2和Beclin-1多克隆抗体和内参β-actin（Millipore），工作液按1∶300稀释。辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗（Dako Cytomation，USA）。real-time PCR试剂盒∶High Pure RNA Tissue Kit、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、LightCycler?（Roche公司）。TRIzolReagent（Invitrogen公司）。DAB显色试剂盒由我院病理科提供。

1.3 引物设计与合成 按照PCR引物设计原则并利用Primer Primiers 5软件和在线Oligo Calculator工具设计Beclin-1，Bcl-2，β-actin引物序列（表2），引物交由上海英俊生物技术有限公司合成。

表2 Beclin-1，Bcl-2，β-actin引物序列

1.4 免疫组织化学法 活检组织经常规HE染色确诊，组织切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，3% H2O2，室温孵育10分钟，水洗4分钟×4次。采用高压锅水浴法热修复的方法进行抗原修复，自然冷却后PBS缓冲液洗4分钟×4次。分别滴加兔抗人Bcl-2和Beclin-1多克隆一抗工作液，于4℃冰箱孵育过夜。从冰箱中取出切片后用PBS缓冲液洗4分钟×4次，滴加羊抗兔二抗工作液，37℃孵育30分钟。切片取出后用PBS缓冲液洗4分钟×4次，DAB显色剂显色3min，苏木素复染。以PBS液代替一抗作阴性对照。Bcl-2和Beclin-1用经过3次重复检测均为

阳性的病例作为阳性对照。免疫组化切片在光镜× 400下进行图像分析（IPWIN60图像荧光分析软件），每张切片观察5个高倍视野，分别测量细胞质中Bcl-2、Beclin-1表达的平均光密度值。

1.5 realtime-PCR方法 术后冰冻组织标本，每份冻存标本取1mm3剪碎研磨，加入1mL Trizol溶液裂解，按Trizol试剂盒说明书采用一步法提取总RNA。realtime-PCR检测方法参照Roche说明书进行检测。

1.6 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，两组Beclin 1和Bcl-2在肺腺癌中表达的相关性进行χ2检验。比较治疗后两组间Bcl-2和Beclin-1表达差异，组间分析采用Fisher’s exact test检验，组内分析采用 nonparametric Wilcoxon matched-pairs test。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 免疫组化结果 本实验中收集所有肺癌组织均经过HE染色证实其为肺腺癌。术前活检组织切片进行免疫组织化学染色检测，结果显示Bcl-2和Beclin-1在癌组织中表达呈深褐色染色，主要表达于肿瘤细胞质内（图1）。术前活检Bcl-2和Beclin-1蛋白表达与分组的关系差异无统计学意义（表3）。

图1 a 肺腺癌中Bcl-2蛋白的表达情况（400×）

图1 b 肺腺癌中Beclin-1蛋白的表达情况（400×）

表3 术前活检Beclin 1和Bcl-2在肺癌组织中的表达情况

2.2 Beclin 1与Bcl-2在人肺癌组织中表达的相关性 Beclin 1与Bcl-2蛋白在人肺癌组织中表达的平均光密度值散点图显示，并经Pearson相关性分析两者呈负相关性（r=-0.43，P<0.001）（图2）。

图2 Beclin-1、Bcl-2的平均光密度值散点图

2.3 Realtime-PCR结果 Bcl-2和Beclin-1 mRNA表达水平化疗组比对照组明显增高（图3）。（1）对照组Bcl-2（3.692±0.1549）与化疗组Bcl-2（4.262± 0.1859），经治疗后Bcl-2明显升高，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。（2）对照组Beclin-1（2.815± 0.1283）与化疗组Beclin-1（5.345±0.1399），经治疗后Beclin-1明显升高（图4），两组比较差异有统计学意义（P<0.01）。

图3 Bcl-2和Beclin-1mRNA癌中表达水平

3 讨 论

随着临床研究不断深入，新辅助化疗联合手术成为治疗局部晚期肺癌的新方法。术前予以化疗可使肿瘤细胞活力降低，肿瘤缩小，有利于肿瘤切除。但化疗有时会导致肿瘤细胞对化疗药物的获得性耐药，以及肿瘤细胞的凋亡缺陷或受阻常是导致化疗失败的关键因素。如何提高治疗效果，防止耐药株的产生成为治疗的关键。如何在治疗前基因水平预判术后疗效及预后成为选择治疗方法的关键。

Beclin-l基因是目前发现的哺乳动物唯一自噬基因。主要作用是调节自噬水平参与细胞内大分子物质的循环及再利用受损细胞器的清除，并维护细

胞内环境稳态。Beclin-1的下调能导致自噬、凋亡的缺陷、细胞恶性度增加、促进肿瘤的发生和进展。Bcl-2家族是与凋亡有关的基因家族，包括不同功能的癌基因，Bcl-2、Bcl-xL在许多肿瘤中表达较高，其下调促进自噬发生。而Bcl-2基因是凋亡调节基因家族中的代表，其过度表达可抑制细胞凋亡，进而促进细胞的异常增殖和恶性转化。文献报道，Bcl-2基因表达上调可导致肿瘤细胞对化疗药物耐药，而体外试验发现抑制Bcl-2基因表达可有效提高NSCLC对顺铂的敏感性[4]。

Swerdlow等[5]发现，Bcl-2下调Beclin-1依赖的自噬及Beclin-1依赖的自噬性细胞死亡，此发现进一步证实了Bcl-2家族成员通过抑制细胞凋亡，进而阻断自噬来发挥原癌基因的作用。同时，Bcl-2家族其他成员也参与自噬的调控。Bcl-2家族通过与Beclin-l总蛋白的BH3结合域结合，达到抑制自噬的作用。文献认为二者在功能上存在联系，即自噬为凋亡所需，自噬通常先于凋亡，进而启动凋亡。自噬抑制凋亡，保护细胞避免发生凋亡和坏死；自噬向凋亡转化，共同促进细胞死亡。但自噬与凋亡间相互转换具体机制还不完全明了。目前凋亡机制已研究甚广，而对自噬性细胞死亡的作用机制还在研究。据报道40%～75%的人类偶发性乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌细胞中Beclin-1存在单等位基因缺失。Beclin-1等位基因敲除的小鼠自发性恶变几率增加[6]。郑海燕等[7]研究发现Beclin-1蛋白表达缺失利于肺部肿瘤的发生、发展，随着肿瘤的进展和分化程度的降低，Beclin-l的阳性表达率逐渐下降。而作为凋亡抑制基因的Bcl-2基因，在肺癌及癌前病变组织中的表达高于在正常肺组织中的表达。Bcl-2在Ⅲ+Ⅳ期中的表达高于Ⅰ+Ⅱ期，在有淋巴结转移癌中的表达高于无淋巴结转移癌。Beclin-1与抗凋亡基因Bcl-2在原发性肺癌中的阳性表达率密切相关。Bcl-2和Beclin-1共同参与了肺癌的发生发展，在人体内Bcl-2与Beclin-1之间的关系与化疗间联系尚报道不多。

以铂类为主的化疗药是用于肺癌的一线化疗药物，但其肿瘤耐药性一直是临床治疗难以克服的障碍，有研究表明[8]DDP等药物可引起肿瘤细胞发生自噬，说明自噬可能与肿瘤耐药性存在一定的关系。本文研究了新辅助DP方案治疗后肿瘤组织中Beclin-1与Bcl-2基因分子水平的变化，发现Bcl-2经治疗后略微下降，而Beclin-1升高更明显。说明经化疗后肿瘤自噬增加，导致了肿瘤间部分细胞的自噬性死亡。而Bcl-2经化疗后表达水平略微下降，术后病理提示部分肿瘤细胞仍然具有活性，部分患者体内的Bcl-2仍发挥着抗凋亡作用，说明化疗后Bcl-2高表达有可能是导致治疗失败的可能因素之一。也有可能化疗后的肿瘤细胞Beclin-1的增高，导致自噬作用增强，通过自噬作用清除掉受损肿瘤细胞，使肿瘤细胞内环境达到稳定状态，使其部分长期生存。而Bcl-2的增多抑制了细胞凋亡，使得细胞凋亡不足，导致本应通过凋亡死亡的细胞不能发生凋亡。从而引起肿瘤细胞的异常增多，最终导致肿瘤化疗后仍具有活性。

有研究[9]表明沉默Beclin-1基因表达，能抑制肿瘤细胞恶性增殖信号传导，阻滞细胞周期进展，使细胞增殖能力下降，提高A549/DDP细胞的化疗敏感性，抑制细胞的增殖能力。本文采用realtime PCR技术检测其表达水平，观察其表达差异。探讨其在肿瘤化疗前后差异，观察其表达水平，有助于帮助选择手术后辅助化疗适用对象和优化治疗方案，提高治疗疗效。为针对同一家族的Beclin-1和Bcl-2作为联合基因治疗靶点提供参考，从而提高治疗疗效。新辅助化疗能降低肿瘤分期，增加手术切除率，从而提高患者的生存质量甚至生存率，但肿瘤细胞的抗药性导致新辅助化疗疗效存在较大差异。本研究应用realtime PCR法检测患者癌组织中的原癌基因Bcl-2和自噬基因Beclin-1表达水平，结合新辅助化疗的疗效进行分析，旨在寻找肺癌的化疗耐药因子，判断患者预后可能存在的敏感性指标，制定出更有效的个体治疗方案。

目前，新辅助化疗是肺腺癌有效的综合治疗手段之一，对于Bcl-2高表达和Beclin-1低表达的患者，选择何种化疗方案进行新辅助化疗值得进一步研究。选择合适化疗方案能够延长患者生存时间，Bcl-2明显升高患者，术后辅助化疗可选择非铂的化疗方案，以提高治疗疗效。检测新辅助化疗对Bcl-2和Beclin-1表达的影响，有助于探讨新辅助化疗对肿瘤耐药性的影响和指导肺腺癌的个体化治疗，这将成为本课题组今后的研究重点。

[1]Losert D，Pratscher B，Soutschek J，et al.Bcl-2 downregulation sensitizes nonsmall cell lung cancer cells to cisplatin，but not to docetaxel［J］.Anticancer Drugs，2007，18（7）∶755-761.

[2]Li J，Viallet J，Haura EB.A smallmolecule pan-Bcl-2 family inhibitor，GX15-070，induces apoptosis and enhances cisplatin-induced apoptosis in non-small cell lung cancer cells ［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2008，61（3）∶525-534.

[3]Kim R，EmiM，Tanabe K，et al.Therapeutic potential of antisense Bcl-2 as a chemosensitizer for cancer therapy［J］. Cancer，2004，101（11）∶2491-2502.

[4]Huang Z，Lei X，Zhong M，et al.Bcl-2 small interfering RNA sensitizes cisplatin-resistant human lung adenocarcinoma A549/DDP cell to cisplatin and diallyl disulfide［J］.Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2007，39（11）∶835-843.

[5]Swerdlow S，Distelhorst CW.Bcl-2-regulated Calcium signals as common mediators of both apoptosis and autophagy ［J］.Dev Cell，2007，12（2）∶178-179.

[6]Shen Y，Li DD，Wang LL，et al.Decreased expression of autophagy-related proteins in malignant epithelial ovarian cancer［J］.Autophagy，2008，4（8）∶1067-1068.

[7]郑海燕，李芳，王新允,等.自噬基因Beclin-1在不同进展阶段肺癌组织芯片中表达及意义［J］.中华老年医学杂志，2010，29（12）∶1017-1019.

[8]刘东雷，王建军，杨洋，等.自噬在顺铂诱导的食管癌细胞死亡中的作用［J］.中华实验外科杂志，2010，27（9）∶1198-1199.

[9]任爽，秦艳茹，张岩，等.自噬相关基因Beclin 1沉默对人肺癌A549细胞顺铂耐药性的影响［J］.中国老年学杂志，2014，10（10）∶2809-2810.

The effect of neoadjuvant chemotherapy on the expression of lung cancer related genes Bcl-2 and Beclin-1 in lung adenocarcinoma

LIU Yupeng1,ZHU Yejing2,CHEN Yuan1,QIAN Jun2,HUANG Xianghua1,ZHOU Xiaomei1,
LIU Yushan3,ZHANG Yixin1,SHIMinxin1,MAO Qinghua1
（1Department of Surgery,Nantong Tumor Hospital,Jiangsu 226001；2Medical School of Nantong University；3Departmentof Pathology,Nantong Tumour Hospital）

Objective:To investigate the expressions of Bcl-2 gene and Beclin-1 gene and the efficacy of neoadjuvant chemotherapy in patientswith stage II-III lung adenocarcinoma.M ethods:Eighty patientswith stageⅡ-Ⅲlung adenocarcinomawere randomly divided into two groups and were enrolled in the study before chemotherapy:one group accepted operation treatment after two weeks of neoadjuvant chemotherapy;the another directly accepted operation treatment.The expression of Bcl-2 and Beclin-1 were detected bv immunohistochemistry before chemotherapy and the correlation of the expression of Bcl-2 and Beclin-1 the response rate of chemotherapy was analyzed.ThemRNA expression of Bcl-2 and Beclin-1 weremeasuerd by realtime-PCR after neoadjuvant chemotherapy.The relationship between the two groups and the change of the gene expression levels under the impact of neoadjuvant chemotherapy was studied.Result:There was no difference in Bcl-2 and Beclin-1 protein expression between the groups before chemotherapy,and was negatively correlated between Beclin 1 and Bcl-2 expression levels in lung adenocarcinoma（r=-0.43,P<0.001）.Itwas showed that Bcl-2 and Beclin-1mRNA levelswere significantly differentafter neoadjuvant chemotherapy by realtime PCR.The results showed that themRNA levels of Beclin-1 expression were significantly higher in chemotheroapy group than control group while the expression of Bcl-2 decreased.The gene expression levelswere the significant difference between the two groups（P<0.05）.Conclusion:The data indicated that neoadjuvant chemotherapymight influence the expressions of Bcl-2 and Beclin-1 in lung adenocarcinoma and provide clinical reference for the inhibition of Bcl-2 expression.

lung adenocarcinoma；neoadjuvant chemotherapy；Bcl-2；Beclin-1；real time polymerase chain reaction; immunohistochemistry

R734.2

A

刘郁鹏，男，汉族，江苏南通人，生于1981年7月，硕士，主治医师。研究方向∶主胸部肿瘤外科的诊断与综合治疗。 通信作者∶毛清华，E-mail∶mqhchf69@sina.com

2014-09-14

1006-2440（2014）05-0449-05

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是我国最常见的恶性肿瘤之一。2010年卫生统计年鉴显示，2005年肺癌死亡率占我国恶性肿瘤死亡率的第1位。现在治疗手段有限，且治疗效果

和预后均不理想。临床I、II期患者经过标准的外科治疗后，5年生存率达40%，而局部晚期患者据病变的范围和是否可切除，其5年生存率为5%～35%。肺腺癌属于NSCLC一种，常常好发于肺周围，起病隐秘，早期无征兆，通常诊断出来时已经是晚期，易发生胸壁转移。其中癌基因Bcl-2在包括NSCLC在内的多种肿瘤组织中过表达，并不同程度地抑制化疗药物介导的细胞凋亡[1]。研究发现下调Bcl-2基因表达可促进细胞凋亡，提高NSCLC对顺铂的敏感性，增强阿霉素、依托泊苷、5-氟尿嘧啶等化疗药物对某些肿瘤细胞的杀伤能力[2]。因此抗凋亡癌基因Bcl-2和抑癌基因Beclin-1，在调节细胞死亡及提高肿瘤细胞对化疗药物敏感性方面发挥着重要作用[3]。目前，术前采用新辅助化疗的治疗方法越来越受到重视。本研究回顾性调查我院2008年1月—2013年12月收治的II～IIIA期肺腺癌患者，以Bcl-2和Beclin-1水平为指标分析单纯手术治疗和术前配合新辅助化疗的临床疗效，为疗效判断及预后评价提供科学依据。