季俐俐，倪婷婷，张冬梅，，刘益飞，沈雁波，王颖颖

（南通大学医学院1病理解剖学教研室；2病原微生物学系；3基础医学研究室，江苏226001；南通大学附属医院4病理科；5急诊科）

·论著与基础研究·

非小细胞肺癌中TRA2B表达意义的初探*

季俐俐1**，倪婷婷2，张冬梅2，3，刘益飞4，沈雁波5，王颖颖3

（南通大学医学院1病理解剖学教研室；2病原微生物学系；3基础医学研究室，江苏226001；南通大学附属医院4病理科；5急诊科）

目的：探讨TRA2B在非小细胞肺癌中的表达情况，并分析其与肺癌临床病理特征之间的关系。方法：Western blot检测6对肺癌组织和癌旁非肿瘤组织中TRA2B的蛋白表达水平，免疫组织化学染色分析93例非小细胞肺癌组织中TRA2B的表达。结果：TRA2B在肺癌组织中表达水平高于癌旁非肿瘤组织，TRA2B的表达情况与肺癌的分化程度以及临床分级相关（P<0.05）。结论：TRA2B在非小细胞肺癌中表达上调，提示TRA2B可能可以作为诊断肺癌的潜在标记物以及治疗的潜在靶点。

TRA2B；肺癌；免疫组化；预后

肺癌是中国及世界范围内常见的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌所占比例大于80%[1]。肺癌的发生是一个多步骤的过程，涉及到促癌基因和抑癌基因的遗传以及后生的变化，信号传导途径的激活，最终导致细胞增殖和存活机制的失调[2]。尽管肺癌的诊断和治疗手段有所进步，但是大部分肺癌患者的预后仍然不好。有效识别肺癌发生过程中的分子机制对于肺癌的有效治疗是十分重要的。

TRA2B是一个富含丝氨酸/精氨酸样的蛋白，参与前体mRNA的选择性切割[3]。之前的文献报道，TRA2B参与许多生理和病理的过程，包括中风，神经前体的存活，平滑肌细胞的增殖[4-6]；此外，TRA2B还被报道参与一些肿瘤的进程，包括：宫颈癌，乳腺

癌和结肠癌[4，7-8]。但是目前关于TRA2B在肺癌中的表达情况以及作用还没有明确的报道。本文主要检测TRA2B在肺癌组织中的蛋白表达水平，探讨TRA2B的表达与肺癌的发生发展的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料 标本收集自南通大学附属医院，为2006年~2009年93例确诊为非小细胞肺癌的住院手术标本，男52例，女41例，部分标本置于-80℃保存，其余置于10%甲醇中固定，常规石蜡包埋。对肿瘤标本的使用研究获得南通大学医学院伦理委员会的批准，并且获得患者的知情同意。

1.2 实验方法

**[作者简介]季俐俐，女，汉族，江苏南通人，生于1979年3月，博士，讲师，研究方向：肿瘤病理。 通信作者：王颖颖，Tel：051385051736，E-mail：wyy0418@ntu.edu.cn

1.2.1 Western印记：每0.1g新鲜组织加入1 000μL组织裂解液，匀浆器粉碎后冰上静置30分钟，离心提取上清。加入上样缓冲液煮沸15分钟变性，上样量50μg，电泳，转膜后脱脂牛奶室温封闭2小时，一抗TRA2B（Abcam，货号ab31353，小鼠源性，稀释度1∶500）4℃孵过夜，洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液(山羊抗鼠，稀释度1:5000)室温孵育2小时，TBST洗膜10分钟3次，洗膜后ECL发光。

1.2.2 免疫组织化学染色：免疫组化采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(SP)法。染色采用北京中杉金桥生物技术公司提供的美国ZYMED公司SP（过氧化物酶标记的链霉卵白素）系列试剂盒。制备石蜡切片后，60℃烤片8小时，二甲苯脱蜡15分钟2次，梯度乙醇水化，高压加热法修复抗原。冷却至室温后滴加3%去离子水孵育10分钟，PBS洗3分钟3次。采用正常山羊血清封闭10分钟。孵育一抗TRA2B（Abcam，货号ab31353，小鼠源性，稀释度1∶100），4℃过夜。PBS洗3分钟3次后孵育生物素化山羊抗鼠二抗工作液室温孵育15分钟，PBS 3分钟洗3次。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育15分钟。PBS洗去后DAB染色，苏木素复染，无水乙醇脱水，封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。1.2.3 免疫组化结果分析：由两名病理科医师在双盲情况下对每张切片进行染色评价。DAB染色呈棕黄色为阳性。结果根据染色阳性细胞数和染色强度综合评定。阳性细胞比例0~25%为0，26%~50%为1,51%~75%为2,76%~100%为3。染色强度评分标准为：无着色为0，浅黄色为1，棕黄色为2，棕褐色为3。将两者相乘，结果>4者为高表达，0~3者为低表达。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件进行数据分析，两样本间率比较用χ2检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Western印记检测TRA2B表达 在6对肺癌组织以及癌旁非肿瘤组织中检测TRA2B的蛋白表达水平，结果显示在肿瘤组织中的表达水平高于癌旁非肿瘤组织，见图1。

2.2 免疫组化法检测TRA2B在肺癌癌组织的表达TRA2B主要定位于细胞核，DAB染色呈棕黄色为阳性。统计分析结果显示，TRA2B的表达主要与肺癌的分化程度以及临床分级相关（P<0.05），与患者的性别，年龄，肿块大小和肿瘤淋巴结转移等无明显相关性（P<0.05），见表1。

图1 TEA2B在肺癌组织和癌旁非肿瘤组织中的表达

图2 TEA2B在不同分化非小细胞肺癌中的表达

表1 TRA2B的表达与临床病理特征的关系

3 讨 论

选择性切割是一个重要的调节基因表达的机制，人类的大部分转录物都会被选择性切割，通过选择性切割修饰后的蛋白表达会影响细胞的生物学特性[4]。富含丝氨酸/精氨酸蛋白的RNA结合蛋白家族是必要的前体mRNA剪切因子[6]。TRA2B是一个富含丝氨酸/精氨酸样的蛋白，由位于人类染色体三号位的TRA2B基因编码(也称为SFRS10)[9]。TAR2B是在大鼠的星型角质细胞中作为一个新的RNA结合蛋白发现的，是果蝇TRA2的人类同系物，在果蝇体内TRA2可以调节在性别分化过程中许多重要基因的性别特异性前体。在哺乳动物中，有两个哺乳动物的同系物：TRA2A和TRA2B,TRA2B是一个序列特异性的前体mRNA剪切增强子，可以以一个浓度依赖的方式结合到富含嘌呤的增强子序列[3]。

之前的研究表明，TRA2B在生理和病理过程中发挥着许多作用。TRA2B对于正常的小鼠胚胎发育是必要的，TRA2B的缺乏会导致小鼠胚胎发育异常[10]。TRA2B对于神经前体细胞的存活是必要的[6]。除此以外，TRA2B在肿瘤的发生发展过程中也发挥着作用。在乳腺癌中，TRA2B参与CD44的选择性切割，并且在侵袭性乳腺癌中的表达高于对应的正常乳腺组织[7]。在宫颈癌，卵巢癌以及结肠癌中，TRA2B的表达上调。在结肠癌中，TRA2B发挥着促进肿瘤细胞增殖抑制凋亡的作用[8]。

本次研究主要探讨了TRA2B在非小细胞肺癌组织中的表达情况以及TRA2B的表达与相关的临床病理特征之间的关联。首先，用免疫印记的方法检测了六对非小细胞肺癌肿瘤组织与癌旁非肿瘤组织中TRA2B的蛋白表达情况，发现在肿瘤组织中TRA2B的蛋白表达显著高于对应的非肿瘤组织。此外还用免疫组织化学染色的方法进一步分析TRA2B的表达，结果表明，TRA2B的表达与肺癌的分化程度以及临床分级具有相关性（P<0.05）。在组织分化低的肺癌组织中，TRA2B的表达高于组织分化高的肺癌组织，并且临床分期晚的患者的TRA2B的表达水平高于临床分期早的患者。因此TRA2B的表达与肺癌的进程有关，但是在肺癌进程中发挥的具体作用还不明确，有待进一步的研究来阐明。

[1]Ji XD,Li G,Feng YX,et al.EphB3 is overexpressed in non-small-cell lung cancer and promotes tumor metastasis by enhancing cell survival and migration[J].Cancer Res, 2011,71(3):1156-1166.

[2]Bae KM,Wang H,Jiang G,et al.Protein kinase C epsilon is overexpressed in primary human non-small cell lung cancers and functionally required for proliferation of non-small cell lung cancer cells in a p21/Cip1-dependentmanner[J].Cancer Res,2007,67(13):6053-6063.

[3]Takeo K,Kawai T,Nishida K,et al.Oxidative stress-induced alternative splicing of transformer 2beta(SFRS10)and CD44 pre-mRNAs in gastric epithelial cells.Am J Physiol Cell Physiol[J].2009,297(2):C330-338.

[4]Gabriel B,Zur Hausen A,Bouda J,etal.Significance of nuclear hTra2-beta1 expression in cervical cancer[J].Acta Obstet Gynecol Scand,2009,88(2):216-221.

[5]Tsukamoto Y,Matsuo N,Ozawa K,et al.Expression of a novel RNA-splicing factor,RA301/Tra2beta,in vascular lesions and its role in smoothmuscle cell proliferation[J].Am J Pathol,2001,158(5):1685-1694.

[6]Roberts JM,Ennajdaoui H,Edmondson C,et al.Splicing factor TRA2B is required for neural progenitor survival[J].J Comp Neurol,2013，522（2）：372-392.

[7]Watermann DO,Tang Y,Zur Hausen A,etal.Splicing factor Tra2-beta1 is specifically induced in breast cancer and regulates alternative splicing of the CD44 gene[J].Cancer Res, 2006,66(9):4774-4480.

[8]Kajita K,Kuwano Y,Kitamura N,et al.Ets1 and heat shock factor 1 regulate transcription of the Transformer 2beta gene in human colon cancer cells[J].J Gastroenterol,2013，48 （11）：1222-1233.

[9]Best A,Dagliesh C,Ehrmann I,et al.Expression of Tra2 beta in Cancer Cells as a Potential Contributory Factor to Neoplasia and Metastasis[J].Int JCell Biol,2013,2013:843781.

[10]Mende Y,Jakubik M,Riessland M,et al.Deficiency of the splicing factor Sfrs10 results in early embryonic lethality in mice and has no impact on full-length SMN/Smn splicing [J].Hum Mol Genet,2010,19(11):2154-2167.

Prelim inary study of significance of TRA2B expression in non-small cell lung cancer

JILili1,NITingting2,ZHANG Dongmei2，3,LIU Yifei4,SHEN Yanbo5,WANG Yingying3
(1Departmentof Pathology,2Department of Pathogen Biology,3The Basic Medical Research Center,Nantong University, Jiangsu 226001;4Departmnetof Pathology;5Depantmnet of Emergency,the Affiliated Hospital of Nantong Univeristy)

Objective:To analyze the expression of TRA2B in Non-small cell lung cancer and the relationship between the expression of TRA2B and its clinicopathologic variables.Methods:The expression of TRA2B in 6 pairs of tumor tissues and adjacent nontumorous tissueswas detected by Western blot,and immunohistochemistry technique was used to analyze the expression of TRA2B in 93 lung cancer samples.Results:The expression of TRA2B was higeher in lung cancer tissues than in adjacent nontumorous tissues and the expression of TRA2B had a correlation with the clinical stage and histological differentiation.Conclusion:TRA2B was overexpressed in lung cancer and TRA2B might be a potential marker for lung cancer diagnosis and a potential target for lung cancer therapy.

TRA2B;NSCLC;immunohistochemistry;prognosis

R734.2

A

国家自然科学基金青年基金资助项目（81302285）。

2013-09-23

1006-2440（2014）01-0024-03