尚宏华 郭建平 谢秋梅

（中牧股份江西生物药厂，江西 南昌 330200）

猪瘟活疫苗外源病毒BVDV细胞培养与PCR检测的比较

尚宏华 郭建平 谢秋梅

（中牧股份江西生物药厂，江西 南昌 330200）

采用细胞培养法和PCR方法，一次性对中股份江西生物药厂生产的18批猪瘟活疫苗（细胞源）进行了外源病毒BVDV(牛病毒性腹泻病毒)两种方法的检测，并进行了比较。结果显示：细胞检验外源病毒方法除了能用荧光抗体检测BVDV外，还能通过致细胞病变检查和红细胞吸附试验检测蓝舌病毒、细小病毒等其它外源病毒；而PCR方法检测的是病毒核酸，并不能鉴别病毒活性，另外，由于PCR灵敏度高，容易出现假阳性，如果不对DNA测序，可能出现假阳性而导致结果误判，给生产企业造成巨大的经济损失。

猪瘟活疫苗；外源病毒；PCR检测；比较

为了保证病毒性生物制品安全有效，任何一种生物制品都不允许存在与产品无关的外源病毒。如果病毒性生物制品携带外源病毒，不仅不能有效预防疾病，甚至还可能成为传播动物疫病的媒介，给养殖业带来严重的经济损失。对于猪瘟活疫苗外源病毒检验，其检验标准已在《中华人民共和国兽药典》（2010年版三部）中有明确的规定。法定的猪瘟活疫苗外源病毒检验是通过细胞培养后进行荧光抗体检查、致细胞病变检查和红细胞吸附试验来判定有无外源病毒污染[1]。但随着PCR技术的发展，许多生物制品生产企业、高等院校、研究所、大型养殖场常用PCR检测生物制品外源病毒污染情况。本文采用细胞培养法和PCR方法，一次性对本厂生产的18批猪瘟活疫苗（细胞源）进行了BVDV外源病毒两种方法的检测，并进行了比较。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1绿猴肾（Vero）传代细胞、PK-15传代细胞、MDBK传代细胞。

1.1.2连续18个批号的猪瘟活疫苗（细胞源）。

1.1.3主要试剂、仪器。DMEM培养液（（GIBCO））、新生胎牛血清（GIBCO）、BVDV间接免疫荧光检测试剂盒（中监所）、BVDV阳性毒株Oregonc24v（中监所）、豚鼠红细胞、鸡红细胞、吉姆萨染色液（Sigma）、倒置荧光显微镜（日本Olypus），5%CO2细胞培养箱（SANYO）。病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒（TIANGEN）、一步法RT-PCR试剂盒（TIANGEN）、PCR仪（美国ABI）。

1.2方法

1.2.1细胞培养法检验BVDV参照《中华人民共和国兽药典》（2010年版三部）外源病毒检验方法[2]。

1.2.1.1样品处理。每批疫苗样品取3瓶，用DMEM液按要求稀释成每毫升10头份，混匀、混合离心，取上清液作为被检样品。

1.2.1.2样品的接种、培养与检验。接种1mL已处理被检样品至长成良好单层的Vero、PK-15、MDBK细胞，另各设一瓶正常细胞对照，细胞培养5d、10d后反复冻融细胞3次，连续继代2次。培养期间观察细胞病变情况，最后一次继代的细胞用荧光抗体检查法、致细胞病变检查和红细胞吸附试验进行外源病毒检验。

1.2.2外源病毒BVDV PCR检验是由上海兽医研究所提供引物，该厂检验人员建立的BVDV检验方法。

1.2.2.1取猪瘟活疫苗3瓶，生理盐水稀释后混合、混匀。按照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明提取病毒RNA。

1.2.2.2按照一步法RT-PCR试剂盒说明，进行反转录和PCR扩增，另设阴阳性对照。

1.2.2.3电泳、拍照。

2 结果

2.1外源病毒BVDV细胞检测结果

Vero、PK-15、MDBK细胞在接种猪瘟活疫苗后连续继代2次，均无细胞病变。最后一次继代后的MDBK细胞用BVDV间接免疫荧光试剂盒染色、镜检，结果除BVDV阳性对照出现特异性荧光外，所有检测样品均无出现BVDV特异性荧光，Vero、PK-15细胞分别进行致细胞病变和红细胞吸附试验，结果均无细胞病变和红细胞吸附现象。图1、2、3、4、5、6分别为部分样品荧光染色、致细胞病变和红细胞吸附图片。

图1 BVDV阳性对照荧光染色（100ⅹ）

图2 接种疫苗样品荧光染色（100ⅹ）

图3 正常PK细胞致细胞病变（200ⅹ）

图4 接种疫苗样品致细胞病变（200ⅹ）

图5 正常PK细胞红细胞吸附（200ⅹ）

图6 接种疫苗样品红细胞吸附（200ⅹ）

2.2外源病毒BVDV PCR检测结果（如图7）

图7 21:DNAMarker（DL2000）；20:BVDV阳性对照；19：阴性对照；1～18：猪瘟疫苗样品

被检疫苗样品除7、16号样品和阳性对照出现309bp目的条带，其它样品及阴性对照均未检测到BVDV。同时将18批疫苗接种MDBK细胞，连续继代2次，收集BVDV荧光染色时的MDBK细胞培养物进行了BVDV的PCR扩增，结果18个样品均为阴性。

2.3所有样品检验结果见表1。

表1 各样品外源病毒BVDV不同检测方法结果比较

3 讨论与分析

在疫苗生产过程中，外源病毒污染主要通过种毒、细胞、血清、胰酶等生物活性材料以及操作人员、容器、设备。各批疫苗生产之前，所有活性材料都采用细胞培养法并结合PCR检测方法对外源病毒进行监控，无论是细胞检验法还是PCR检测阳性的原材料，都将严格按照GMP要求进行报废处理，从源头上切断了外源病毒对疫苗的污染。整个生产过程严格按照GMP要求进行生产，工艺成熟而稳定，减少了人为的操作污染。

在进行猪瘟活疫苗外源病毒检验时，一次性对该厂生产的连续18个批号的猪瘟活疫苗外源病毒BVDV进行了细胞检测和PCR检测，结果显示，细胞检验外源病毒方法除了能检测BVDV外，还能检测到其它的蓝舌病毒、细小病毒等外源病毒。18个疫苗样品接种Vero、PK-15和MDBK细胞后连续继代2次，通过荧光抗体检查、致细胞病变检查和红细胞吸附试验，结果均无外源病毒污染。而PCR检验结果有2个样品为BVDV阳性，为进一步验证检验结果，将疫苗接种细胞连续继代2次后的MDBK细胞培养物也进行了BVDV PCR扩增，结果均为阴性。出现这种结果，可能有两种原因，一是疫苗产品中可能存在BVDV病毒核酸，但并不是活病毒，另一种可能是由于PCR灵敏度高而出现的假阳性，理论上这两种可能都会导致疫苗直接PCR检验出现阳性结果，而经过敏感细胞几代培养后PCR检测出现阴性结果。

近年来，随着PCR技术的快速发展和广泛应用，许多研究人员已经将PCR技术应用于BVDV的检测，并且取得了一定的成效。但PCR方法从样品RNA提取、反转录到PCR扩增及电泳检测，全部过程对环境要求严格，操作要求细致，否则由于PCR具有高灵敏度容易出现高阳性率，如果对阳性结果不做基因测序，经常会出现假阳性的结果偏差。另外，PCR方法的确能快速帮助初步判定产品有无特异性外源病毒污染，但因该法检验的是病毒核酸，并不能鉴别病毒活性，需要对基因进行测序，并采用细胞法检验其活性，这是PCR检验生物制品外源病毒存在的局限性。在实际检验工作中，要严格贯彻执行2010年版《中国兽药典》外源病毒检验法来判定有无外源病毒污染，PCR检验只能作为生物制品外源病毒的一种辅助检验手段。

[1]中华人民共和国兽药典[M].2010(第三部).北京：中国农业出版社，2010：附录40～42.

[2]中国兽医药品监察室.非禽源活疫苗外源病毒检验技术[Z].北京：中国兽医药品监察所，2013.

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