袁慰，王永秋

（淮北师范大学化学与材料科学学院，安徽淮北235000）

分析测试

HPLC法测定L-丙氨酸甲酯盐酸盐中L-丙氨酸含量

袁慰，王永秋*

（淮北师范大学化学与材料科学学院，安徽淮北235000）

建立了HPLC法分离测定L-丙氨酸甲酯盐酸盐中L-丙氨酸含量。色谱条件为：Shim-packVP-ODS柱（150mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇-NaH2PO4水溶液，NaH2PO4溶液浓度为0.05mol·L-1、pH值为6.50（H3PO4调节），甲醇与NaH2PO4溶液体积比为1∶9；流速0.80mL·min-1；柱温为30℃；检测波长为210nm；进样量5μL。该方法的建立为L-丙氨酸甲酯盐酸盐的测定提供了新方法。

HPLC；L-丙氨酸甲酯盐酸盐；L-丙氨酸

以氨基酸为原料合成的氨基酸甲酯盐酸盐在药物化学、生物合成化学、食品加工和光学活性材料等领域发挥着重要作用[1-4]。氨基酸甲酯盐酸盐不但有较强的吸水性,而且稳定性较高，干燥后可保存备用，十分方便[5]。目前，有关氨基酸衍生物测定的方法正在不断发展，色谱法、电化学法、毛细管电泳法、分光光度法是常用的方法，但采用液相色谱检测L-丙氨酸甲酯盐酸盐及L-丙氨酸的方法未见报道。本文建立的高效液相色谱测定方法，为生产和使用该产品的企业提供一种检测手段。

1实验部分

1.1 试剂和仪器

L-丙氨酸，L-丙氨酸甲酯盐酸盐，NaH2PO4，KH2PO4均为分析纯，甲醇为色谱纯，超纯水。

岛津LC-20A高效液相色谱仪；岛津SPD-M20A二极管阵列紫外检测器；岛津LC-Solution色谱工作站；Mole超纯制水机（上海摩勒生物科技公司）；pHS-3C酸度计（上海雷磁）。

1.2 溶液配制

精密称取一定量L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯盐酸盐，分别用流动相溶解，并定容到100.0mL。将L-丙氨酸再分别稀释，得到不同浓度的标准品溶液。

1.3 色谱条件

Shim-pack VP-ODS柱（150mm×4.6mm I.D, 5μm）；流动相为甲醇-Na2HPO4水溶液，甲醇与Na2HPO4溶液体积比为1∶9，Na2HPO4溶液浓度为0.05mol·L-1、pH值为6.50（用H3PO4调节）；流速为0.80mL·min-1；柱温为30℃；检测波长为210nm；进样量为5μL。

2结果与讨论

2.1 色谱条件的确定

2.1.1 流动相的选择采用Shim-pack VP-ODS柱，用甲醇-KH2PO4混合水溶液做流动相。分别考察了甲醇与KH2PO4溶液体积比、KH2PO4溶液浓度、pH值对L-丙氨酸和L-丙氨酸甲酯盐酸盐分离的影响，结果表明L-丙氨酸甲酯盐酸盐与L-丙氨酸均不能实现基线分离。

当用甲醇-Na2HPO4混合水溶液为流动相时，L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-丙氨酸的分离度明显增加。当Na2HPO4溶液的浓度由0.01mol·L-1增加到0.05mol·L-1时，分离度增加，继续增加磷酸盐溶液浓度至0.1mol·L-1，发现两者的分离度又变小。

在Na2HPO4溶液浓度为0.05mol·L-1（pH值8.40）不变的前提下，用H3PO4调节其pH值，降低磷酸盐溶液的pH值，分离度有所增加，但pH值低于6.5时，分离度变小。

在Na2HPO4溶液浓度为0.05%mol·L-1，pH值6.5不变的前提下，调节甲醇与Na2HPO4溶液的体积比，由3∶7到2∶8到1∶9，发现两者体积比减小，分离度增加。

故选用Na2HPO4溶液浓度为0.05mol·L-1，pH值6.5（H3PO4调节），甲醇与Na2HPO4溶液体积比为1∶9，作为本研究的最佳流动相参数。

2.1.2 流速和柱温的选择按照上述确定的流动相参数，改变流速（从0.2到1.0mL·min-1）时，发现流速越小，分离效果越好，但是相应的分析时间也会变长，流速为0.8mL·min-1时可达到基线分离。当改变柱温时发现，将柱温升高会导致基线不稳，以30℃较好。

综上所述，色谱条件可确定为：Shim-pack VP-ODS柱（150mm×4.6mm I.D,5μm）；流动相为甲醇-Na2HPO4混合水溶液，Na2HPO4溶液浓度为0.05mol·L-1、pH值6.5.00（H3PO4调节），甲醇与Na2HPO4液体积比为1∶9；流速为0.80mL·min-1；柱温为30℃；检测波长为210nm；进样量5μL。色谱见图1。

图1 L-丙氨酸甲酯盐酸盐色谱图Fig.1The HPLC Chromatograms of L-alanine methyl ester hydrochloride

2.2 标准曲线及线性范围

选取5个适宜浓度的L-丙氨酸标准样品溶液，按照上述确定的色谱条件进样，进样前用0.45 μm膜过滤，按峰面积对浓度进行线性拟合，得到L-丙氨酸的线性回归方程。结果表明，L-丙氨酸在1.01～5.05g·L-1浓度范围内有较好线性关系，线性回归方程为Y=203193X-5466，相关系数为0.9998。L-丙氨酸检出限（S/N=3）和定量限（S/N=10）分别为0.00588和0.0196g·L-1。

2.3 方法的精密度

将L-丙氨酸标准样品溶液分别放置0、1、2、3、4、5h以及0、1、2、3、4、5d，经0.45μm膜过滤后，按上述确定色谱条件进样，记录色图谱数据，按面积-外标法计算日内、日间的RSD，分别为0.77%和1.9%，表明实验精密度较好，误差较小，稳定性较好。

2.4 方法的准确度和重复性

2.4.1 回收率的测定称取一定量L-丙氨酸标准样品，加到L-丙氨酸甲酯混合液中，0.45μm膜过滤，按上述确定的色谱条件进样，平行测定9次，记录数据，按照峰面积-外标法计算含量和回收率，结果见表1。

表1 回收率的测定结果Tab.1The Results of the recovery

由表1可知，平均回收率和RSD均符合正常测定要求，该方法的准确度较高。

2.4.2 重复性的测定称量同一批次的L-丙氨酸甲酯盐酸盐样品6份，每份100.0 mg，用100.0mL流动相溶解，得到样品溶液，用0.45μm膜过滤后，按上述确定色谱条件进样5μL，记录数据，按照峰面积-外标法计算杂质含量，结果见表2。

表2 重复性的测定结果Tab.2The Results of the repetition

由表2可知，RSD为1.97%，说明利用HPLC测量L-丙氨酸甲酯盐酸盐中L-丙氨酸含量重复性较好，试验方法可靠，符合正常检测要求。

3结论

本方法精密度和准确度较高，线性关系良好，且均达到要求，可以定量检测L-丙氨酸甲酯盐酸盐中的L-丙氨酸杂质，为生产和使用L-丙氨酸甲酯盐酸盐的企业提供一种检测手段。

［1］刘蕾,赵瑾,王超杰,等.N-茄呢基谷氨酰胺类化合物的合成［J］.化学研究,2004,15（3）:27-29.

［2］YAYLAYAN V A,KEYHANI A.Carbohydrate and aminoacid degration pathways in L-metionine/D-［13C］glucose model systems［J］.J.Agric.Food Chem.,2001,49（2）:800-803.

［3］NAGAI A,MIYAGAWA T,KUDO H,et al.Controlled cationic ring-opening olymerization of 1,3-oxazolidine-2-thione derived fromL-serine［J］.Mac romolecules,2003,26 25）:9335-9339.

［4］LALLMS,RAMTOHULYK,JAMESMNG,et al.Serine and threonine β-lactones:a newclass of hepatitis a virus 3c cysteine proteinase inhibitors［J］.J.Org.Chem，2002,67（5）:1536-1547.

［5］曾向潮,徐石海,李毅,等.N-（2-吡咯甲酰基）氨基酸甲酯的合成［J］.有机化学,2004,24（7）:802-805.

Determination of L-alanine in L-alanine methyl ester hydrochloride by HPLC

YUAN Wei，WANG Yong-qiu*
（Department of Chemistry and Materials Science,Huaibei Normal University,Huaibei 235000,China）

A method for determining the L-alanine in L-alanine methyl ester hydrochloride by HPLC was established.The chromatography separation was performed on an VP-ODS（150mm×4.6 mm,5μm）；Mobile phase: methanol and disodium hydrogen phosphate aqueous;the concentration of disodium hydrogen phosphate is 0.05 mol·L-1,pH=6.50;methanol:disodium hydrogen phosphate=1∶9;the flow rate is 0.80mL·min-1；column temperature is 30℃;the detection wavelength is 210 nm;the injection volume is 5μL.The establishment of this method for producing L-alanine methyl ester hydrochloride provides a new method for the determination of analysis.

HPLC；L-alanine methyl ester hydrochloride；L-alanine

O657.7

A

1002-1124（2014）02-0017-02

2013-12-10

袁慰（1989-），女，在读硕士研究生，研究方向：氨基酸酯的合成与检测。

导师简介：王永秋（1962-），男，研究方向：化学应用技术开发。