孙晓红，梁晓君，周会祥，冷耀明，王敏

(九江学院附属医院检验科，江西九江332000)

婴儿巨细胞病毒性肝炎外周血Treg及IL-l7表达水平与肝损伤的关联性

孙晓红，梁晓君，周会祥，冷耀明，王敏

(九江学院附属医院检验科，江西九江332000)

目的探讨婴儿巨细胞病毒性肝炎(CMV)外周血调节性T细胞(Treg)及白介素17(IL-17)表达水平与肝脏损伤的关联性。方法43例CMV肝炎患儿根据其肝损伤程度分为轻症组31例、重症组12例，32例健康小儿作为正常对照组。采用流式细胞术检测外周血Treg细胞百分比，ELISA法检测血清IL-17的表达水平，荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测尿HCMVDNA载量，并同时测定血清胆红素、丙氨酸转移酶水平，分析它们之间的关联性。结果43例CMV肝炎组外周血Treg细胞百分比显著低于正常对照组(P＜0.01)，其中重症组外周血Treg细胞百分比也显著低于轻症组(P＜0.01)；而CMV肝炎组血清IL-17表达水平则显著高于正常对照组(P＜0.01)，重症组血清IL-17水平也显著高于轻症组(P＜0.01)；尿HCMV-DNA载量在CMV肝炎各组中差异无统计学意义(P＞0.05)。相关分析显示，外周血Treg细胞百分比与IL-17呈负相关(r=-0.590，P＜0.01)，而血清IL-17水平与血清总胆红素(TBIL)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平呈正相关(r分别为：0.749，0.785，P＜0.01)。结论外周血Treg细胞及IL-17表达失衡可能在婴儿巨细胞病毒性肝炎发病机制中发挥重要作用，且与肝损伤严重程度密切相关。

婴儿；巨细胞病毒性肝炎；Treg；IL-17；TBIL；ALT

婴儿巨细胞病毒性肝炎(infant cytomegalovirus hepatitis，ICH)是指在婴儿时期由于先天或围生期或生后感染人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，CMV)后引起的一类感染性疾病，是由遗传、机体免疫和环境因素共同作用所致，以黄疸、肝脾肿大、肝功能损害为主要临床表现。巨细胞病毒可通过直接损害宿主细胞和免疫损伤引起肝细胞病变，CMV肝炎是其主要临床发病类型之一，常见于年幼和抵抗力弱的儿童，尤其是婴儿期[1]，占婴儿肝炎综合征的50%。本文通过检测CMV肝炎患儿外周血Treg细胞百分比、血清IL-17表达水平及尿人巨细胞病毒(HCMV-DNA)载量，探讨其与肝损伤指标血清血清胆红素、丙氨酸转移酶水平的相关性，从而进一步阐明Treg细胞、细胞因子IL-17介导的婴儿巨细胞病毒性肝炎的发病机制，为该病的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 对象选择2010年2月至2013年4月我院门诊和住院就诊的CMV肝炎患儿36例，其中男20例，女16例，年龄1～3岁，诊断标准采用1998年11月中华医学会儿科分会感染消化学组制定的《巨细胞病毒感染诊断方案》[2]，经PCR-DNA定量检测确诊为CMV病毒感染，均为初发未经抗病毒及免疫抑制剂治疗病例。根据临床及B超排除胆道闭锁排除胆道系统畸形、其他病毒性肝炎(如甲肝、乙肝、丙肝、丁肝、戊肝、EB病毒、风疹病毒、单纯疱疹病毒感染所致的肝炎)及代谢和药物性肝炎等。CMV肝炎组中31例血清总胆红素＜170μmol/L、ALT＜200U/L者划为轻症组，12例血清总胆红素≥170μmol/L和或ALT≥200U/L者划为重症组[3]。正常对照组选择同期在本院健康体检儿童32例，男18例，女14例，年龄1～3岁，经检测肝炎病毒抗体系列：HAV-IgM，乙肝表面抗原(HB-sAg)，丙肝抗体(IgG)，丁肝抗原(HDV-Ag)；戊肝抗体(IgM)，庚肝抗体(IgG)及PCR-CMVDNA均阴性，肝功能正常。随机选取试验对象，使受试者在年龄、性别构成上差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。受试者家属已知情同意本实验，且通过医院学术伦理委员会批准。

1.2 仪器和试剂本研究所用试剂：美国BD公司生产的FITC-CD4抗体、APC-CD25抗体、PEFoxp3抗体；美国R&D公司生产的人IL-17检测试剂盒；中山大学达安基因诊断公司生产的尿CMV-DNA试剂盒。所用仪器：FACSCantoⅡ流式细胞仪(美国BD公司)，2010酶标仪(丹麦Bio-Cell公司)，ABI 7500 FQ-PCR仪(美国ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1 外周血Treg细胞百分率检测全部对象均空腹采集EDTA抗凝血2ml,用淋巴细胞分离后,取白雾层洗涤离心，沉淀后PBS重悬，配成每个流式管内1×106个细胞，再分别加入相应的荧光标记抗体(FITC-CD4、APC-CD25)，避光孵育30min。用透化液洗涤2次后PBS重悬。再加入抗人Foxp3+抗体，避光孵育30min。透化液洗涤细胞2次，按标准操作规程上机检测，分析Treg细胞平均荧光强度。计算CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分率。

1.2.2 血清IL-17水平检测清晨采用普通管抽取实验对象外周血2ml,3000r/min离心10min，吸取上清标本分装于EP管中,置-80OC冰箱冻存。采用双抗体夹心法法测定血清IL-17水平，严格按试剂盒使用说明操作。每样本设3个复孔，酶测试仪450nm处读数。

1.2.3 尿CMV-DNA检测尿CMV-DNA检测采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)。取中段清晨尿液2ml，800g离心10min，取沉淀物检测DNA。使用厂家提供的配套软件，并严格按照试剂说明书操作，每次检测均带室内质控，与样本反应管上机检测。93℃2min预变性进入循环，93℃30s55℃45s扩增40个循环，电脑计算尿CMV-DNA含量。阳性：每毫升尿CMV-DNA载量大于103拷贝。

1.2.4 统计学分析采用SPSS17.0统计学软件。计量资料以x±s表示，采用t检验；计数资料采用χ2检验；相关性分析采用Pearson分析法。以P＜0.05视为具有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血Treg细胞的百分比、血清IL-17水平、尿CMV-DNA含量及血清TBIL、ALT水平CMV肝炎组外周血Treg细胞百分比显著低于正常对照组(P＜0.01)，重症组外周血Treg细胞百分比也显著低于轻症组(P＜0.01)；而CMV肝炎组血清IL-17表达水平则显著高于正常对照组(P＜0.01),重症组血清IL-17水平也显著高于轻症组(P＜0.01)；CMV肝炎组血清TBIL、ALT水平显著高于正常对照组(P＜0.01)；尿HCMV-DNA载量在CMV肝炎各组中差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 各组外周血Foxp3+Treg、IL-17水平、尿CMV-DNA载量、血清TBIL、ALT水平的比较

2.2 相关性分析外周血Treg细胞百分比与IL-17呈负相关(r=-0.590，P＜0.01)，而血清IL-17水平与血清TBIL、ALT水平呈正相关(r分别为：0.749，0.785，P＜0.01)。

3 讨论

巨细胞病毒具有典型的疱疹病毒形态。在自然人群中感染普遍多为隐性，对免疫系统尚未发育完善的婴儿表现为显性感染，若不及早治疗对婴儿危害性很大。日本学者Yasumi等首先提出IL-17是一种肝脏严重性急性损伤的新标志[4]。在肝细胞损害及病毒清除过程中，病毒、机体免疫状态决定了婴儿CMV的持续感染[5]。IL-17是一种前炎症因子，被认为是Thl7细胞产生的最主要的可以标志其亚群的细胞因子，是T细胞诱导的炎症反应早期启动因素，在多种肝病的发病及抗病毒免疫中均有表达[6]。具有较强的炎症介导功能。而Thl7细胞与Treg细胞在分化过程及免疫效应方面存在相互抑制、相互拮抗的效应[7]。CMV最易侵犯管道上皮细胞，尤其是肾脏及肝胆系统[8]，上皮细胞、内皮细胞极易受CMV感染，肝脏作为病毒侵入婴幼儿机体的重要靶器官，CMV感染婴幼儿肝脏及胆管上皮细胞后，经提呈抗原和白细胞粘附，催化产生多种细胞和基因参与免疫、炎症的反应，导致肝脏感染进一步加重[9]。Treg是机体负向调节外来抗原免疫应答的重要细胞亚群，是T淋巴细胞中表达CD4+CD25+Foxp3+的一类T细胞亚型，通过细胞直接接触以及分泌细胞因子IL-10和TGF-β等多种方式来抑制机体对外来物质的有效性、保护性免疫应答。Beriou等研究证实Treg细胞在高水平IL-1与IL-6的体系中可变为分泌IL-17的Foxp3+IL-17细胞，同时失去抑制活性，说明Treg细胞与Thl7细胞的可塑性可能参与了疾病过程[10]。CD4+CD25+Foxp3+是Treg细胞表型标记。其最特异性的转录因子Foxp3+，通过直接与Thl7细胞转录因子ROR结合，抑制ROR介导IL-17A mRNA的转录，影响Thl7细胞的功能[11]，促进Foxp3+对Treg细胞分化成熟和功能的发挥[12]。

为了解感染CMV致肝炎患儿炎症因子分泌水平及T辅助细胞功能状况，以及其与肝功能损害程度的相关性,笔者选择Treg细胞、IL-17、TBIL、ALT水平作为检测指标。结果显示CMV肝炎组Foxp3+Treg显著低于对照组，IL-17水平显著高于对照组，Treg细胞百分比及IL-17含量能够反应机体细胞免疫状况，由此可判断CMV患儿细胞免疫功能异常，细胞免疫状态下降。因此，机体细胞免疫应答状态的改变与CMV患儿的感染密切相关。在肝功能的各项常规检测中，ALT是反映肝细胞损害最敏感的指标，TBIL反映肝脏合成与代谢状态。本研究结果显示，CMV感染患儿ALT、TBIL平均值比正常显著高于正常对照组。提示作为患儿肝细胞损伤的诊断指标，可早期发现症状性婴幼儿CMV肝炎并积极治疗。

采用荧光定量PCR检测技术进行HCMVDNA定量检测，其灵敏度高，已成为临床检测诊断CMV感染的重要手段，可提供病毒在患儿体内存在的直接证据。尿HCMV-DNA水平及其水平的高低可以判断患儿是否感染CMV以及鉴别诊断潜伏性CMV感染和活动性CMV感染[13]。本研究通过荧光定量PCR检测婴儿尿液HCMV-DNA含量，发现CMV肝炎组尿液HCMV-DNA平均含量显著高于正常对照组，因而在CMV肝炎患儿活动性感染的早期诊断和疗效监测方面具有广阔的应用前景。

综上所述，婴儿巨细胞病毒性肝炎其HCMVDNA载量与HCMV疾病严重程度，病毒播散及细胞免疫功能紊乱有很大的相关性。提示在病情治疗过程中，检测患儿的免疫状态以及病毒感染等实验指标，对患儿的病情监测及后续治疗提供了可靠的实验依据。

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R512.6，R446.62

A

1674-1129(2014)05-0528-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.05.013

2014-03-24；

2014-07-11)

孙晓红，女，1971年出生，主管技师，学士学位，主要从事免疫学和微生物学检验。

梁晓君，女，1985年出生，检验师，学士学位，主要从事免疫学检验和临床基础检验。