孙平江 钱荷英 李木旺 张月华 宋红生 徐安英

(1江苏科技大学蚕业研究所， 江苏镇江 212018； 2上海大学生命科学院， 上海 200444)

家蚕以卵滞育，是长期适应不良环境而形成的固有性状。蚕卵滞育的发生与化性有关，主要由遗传因素决定，同时也受温度、光线、湿度和营养等外界条件的影响。家蚕按1年发生世代数的多少，大致可以分为所有的世代都滞育的系统(一化性)、对所处环境应答而决定滞育性的系统(二化性)，以及完全不滞育的系统(多化性)。这些遗传性状是作为地理的变异被固定下来的[1]。其中多化性蚕品种又分为有滞育期多化性和无滞育期多化性2类。已有的研究表明[2-3]，家蚕卵的滞育与否是滞育激素(Diapause Hormone，DH)诱导的，无滞育期多化性品种也存在滞育激素基因，可能是因其不表达或者翻译后滞育激素被降解，从而呈现全年无滞育性的现象。有滞育期多化性蚕品种，常规采用1年春、夏、早秋、晚秋饲养4代进行保育[4]，这样就可以得到足够的适合继代保存的滞育卵；而无滞育期多化性蚕品种则需要全年不间断地饲养，一般每年需要饲养7～8代。

中国农业科学院国家蚕种质资源保存中心承担着10余份无滞育期多化性蚕种质资源的保存任务，而本地区在11月下旬就进入初霜期，晚霜终止期在翌年的3月中下旬，全年无霜期仅230 d左右。因此，每年只能用桑叶养蚕4～5次，再借助人工饲料继代2～3次，才能完成无滞育期多化性蚕品种的保育任务。由于部分多化性蚕品种对人工饲料的摄食性差，这给无滞育期多化性蚕品种的保存带来很大的风险，且劳动强度大，保存成本高。为了减少每年对多化性家蚕品种的保育代数，有必要在不影响蚕品种的化性、主要形态特征和经济性状的条件下，对无滞育期多化性蚕品种在本地冬季的保存方法进行探讨，以求更有效、更安全地保存这些蚕品种资源。

滞育激素对昆虫滞育的影响及作用机理等理论的研究已经比较透彻了[5-7]，而利用滞育激素在家蚕种质资源保存方面的实际应用却未见报道。本研究欲通过对无滞育期多化性蚕品种的蚕蛹，进行微量注射滞育激素的方法，使其蚕蛾能产下滞育卵，以减少饲育世代，降低品种保存的风险和成本。

1 材料与方法

1.1 试验材料

蚕品种： SR5 (代号7025)，无滞育期多化性品种，从泰国引进，中国农业科学院蚕业研究所保存。主要试剂：滞育激素，上海大学生命科学院合成提供。

1.2 试验方法

1.2.1 试验时期 选择在无滞育期多化性蚕品种SR5进行桑叶饲养的最后1个蚕期(晚秋蚕或晚晚秋蚕)进行蛹体注射DH试验，保证多化性蚕品种1年发生4～5代，维持其多化性蚕品种的特性。试验于 2007年10月收蚁饲养，2007年11月上蔟结茧，化蛹24 h后开始蚕蛹注射DH试验；子一代蚕卵的滞育情况与蚕的性状调查于2008年1月进行；子二代蚕卵的滞育情况调查于2008年3月进行。

1.2.2 化蛹经过时间的确定 在25.5 ℃的蔟中环境条件下，在蚕上蔟2 d后采茧，削开尚未化蛹的蚕茧，置于恒温箱中(温度25 ℃、相对湿度65%～75%)保存，观察并记载每头蚕的实际化蛹时间(h)。按化蛹时间的先后顺序将雌蛹、雄蛹分类，进行正常蛹期的保护处理；雌蛹供注射DH用，雄蛹单独另放，不需记载化蛹时间，留待化蛾交配。

1.2.3 DH的配制与注射方法 注射前用无菌水稀释DH, 配制成0.5 μg/μL的DH注射液。设每个蚕蛹DH的注射剂量分别为1.0 μg (注射2 μL)、2.0 μg (注射4 μL) 2个处理，每个处理注射10个雌蛹，3个重复。将不同化蛹时间的雌蚕蛹，用75%的酒精擦拭蛹体，然后用10 μL的微量注射器进行注射，将注射器针头对准蚕蛹的中下部腹节的节间膜处刺入，沿蛹表皮内侧平行向上腹部推进，注射深度约0.5～1.0 cm左右，定量注射后缓慢拔出针头，再用75%的酒精擦拭注射伤口。

1.2.4 注射DH后蚕蛹及蚕卵的保护 将已注射DH的蚕蛹分摊于干净的透气容器盒内，在25～26 ℃的温度和70%～75%的相对湿度条件下保护至羽化，并与正常雄蛾进行交配、产卵，在产卵后的第3天将产下的蚕卵随机分成2份，1份按照常规温湿度标准催青至孵化，调查各蛾圈的滞育卵数及非滞育卵数；另1份蚕种随机选取10蛾圈进行低温冷藏用于后代性状调查试验。

1.2.5 注射DH对后代性状的影响 将1.2.4中保留的10蛾圈蚕卵，在2.5 ℃的条件下冷藏约40 d，取出后按照冷藏浸酸的标准进行浸酸处理后，进行催青、收蚁、饲养，调查注射DH后对滞育卵当代相关性状的影响；产卵后第4天调查卵色与产卵粒数，孵化后调查普通孵化率，孵化后第2天调查卵壳色、产卵粒数与普通孵化率(取10蛾蚕卵的平均数)；收蚁前调查蚁蚕体色，5龄第5天调查壮蚕体色与斑纹；采茧后第4天调查茧色、茧形、全茧量、茧层量、茧层率；用常规方法蛹期保护，发蛾后自交产卵，常规方法催青孵化，调查蚕卵的滞育与否。按以上方法再饲养1期蚕，调查子二代蚕卵的滞育情况。

2 结果与分析

2.1 合适注射DH的化蛹经过时间的确定

对不同化蛹时间的蚕蛹，分别注射不同剂量的DH，各试验区每卵圈产生的滞育卵数量及滞育卵率均有差别。由表1可见,蚕蛹注射DH的有效时间,是化蛹后24～120 h；在这段化蛹时间内，只要对蚕蛹注射适当剂量的DH，均能达到很高的滞育卵率。蚕蛹注射DH的最佳化蛹经过时间为24～86 h，例如在化蛹经过24 h注射2.0 μg的DH稀释液时，滞育卵率达到95.77%；化蛹经过86 h注射2.0 μg的DH稀释液时，滞育卵率同样能达到96.95%，有部分卵圈的滞育卵率达到100%。在这个化蛹阶段(24～86 h)，滞育卵率最低的也有86.90%(注射2.0 μg时)，基本能满足生产和科研的需要。当化蛹时间为120 h时，虽然也产生少量的滞育卵，但其滞育率太低，不能保证生产的需求；当化蛹时间超过149 h后，无论注射多少DH都不能产生滞育卵，即难以再用人为因素(注射DH)进行干涉。

表1化蛹后不同经过时间的SR5蚕蛹用不同剂量DH注射后的蚕卵滞育情况

化蛹后经过时间(h)不受精卵数(粒)非滞育卵数(粒)滞育卵数(粒)良卵数(粒)滞育卵率(%)1 0μg2 0μg1 0μg2 0μg1 0μg2 0μg1 0μg2 0μg1 0μg2 0μg2424321481623636238437861 4695 77451518921824731633933472 8694 615512141261227933140534368 8996 506410221301623632236633864 4895 27721122814431229239333679 3986 90865648112926228637429570 0596 95107150131203246241022725610 573 91120125146250260492542691 573 3514948512983210029832100

调查项目的数据为3次重复试验的平均数；非滞育卵中包含再出卵及转青死卵；滞育卵率以滞育卵数占良卵数的百分比计算。

2.2 合适注射DH剂量的确定

在合适的化蛹时间(24～120 h)内注射适量的DH均能产生数量不等的滞育卵，而产生滞育卵数量的多少，又与其注射的剂量有直接的关系。当化蛹时间在24～86 h时，采用不同的DH剂量注射蚕蛹，结果是DH注射的剂量越大，得到的滞育卵率就越高，滞育卵率以注射2.0 μg DH的处理区高，如在这一时间段的1.0 μg剂量注射区，平均所产卵的滞育卵率为69.52%，当注射剂量提高到2.0 μg时，除了72 h的滞育卵率为86.90%，其余几个时间段的滞育卵率均超过了94.61%。但是，当化蛹时间超过107 h时，则正好相反，DH注射的剂量越大，得到的滞育卵率就越低，如化蛹时间为107 h时， 1.0 μg、2.0 μg注射区的滞育卵率分别为10.57%和3.91%(表1)，其原因有待于进一步探讨。

2.3 蚕蛹注射DH后对蚕卵受精情况的影响

从化蛹后不同经过时间的蚕蛹注射不同剂量的DH后蚕卵的滞育情况看，对蚕蛹注射DH对蚕卵的受精情况产生一定的影响，特别是对化蛹后经过时间长的蛹(107～120 h)影响较大，不受精卵数明显增加(表1)，约占总卵数的32%以上，其余时间的不受精卵率最高的为14%左右，最低的仅为3%左右。

2.4 注射DH对后代性状的影响

通过注射DH得到的滞育卵，在2.5 ℃的条件下冷藏约40 d浸酸处理后饲养，调查其各项性状，除了孵化率稍低与孵化不够整齐以外，其它性状，如幼虫斑纹、体色、龄期经过、茧形、茧色等与对照区并无差异。蚕蛹化蛾后再进行自交产卵，蚕卵直接进行常规催青，结果显示：所有的卵圈中，没有滞育卵，说明DH注射后除孵化率和孵化整齐度有所下降外，对无滞育期多化性蚕品种后代的绝大部分性状不会产生影响，其化性又恢复其多化性的特性。再对子一代非滞育卵进行跟踪调查，其化性依然保持多化性状；还对子二代的蚕卵滞育情况进行了调查，均为非滞育蚕卵。由此可见，通过对家蚕无滞育期多化性蚕品种的雌蚕蛹进行DH注射，能够使无滞育期多化性家蚕蛾产下滞育卵(图1-2)，且其滞育性不具有遗传性，其后代解除滞育后仍恢复无滞育期多化性蚕品种的特性(表2)。

图1 蚕蛹注射DH后产下滞育卵(蚕卵着色)

图2 蚕蛹未注射DH产下非滞育卵(蚕卵不着色)

表2无滞育期多化性蚕品种SR5蚕蛹注射DH后子一代的主要性状

处理区卵色卵壳色蚁蚕体色产卵粒数(粒/蛾)普通孵化率(%)5龄经过(d∶h)全龄经过(d∶h)蚕蛹注射DH淡黄色乳白色黑褐色37694 418∶0025∶12蚕蛹未注射DH淡黄色乳白色黑褐色38592 477∶1225∶00处理区壮蚕体色壮蚕斑纹茧色茧形全茧量(g)茧层量(g)茧层率(%)蚕蛹注射DH青白色素蚕金黄色长椭圆1 020 14013 73蚕蛹未注射DH青白色素蚕金黄色长椭圆1 060 14313 52

3 讨论

家蚕卵的滞育性主要由遗传因素决定，但通过人工的方法可以有效地使其改变，如用冷藏、浸酸等方法可以解除一化、二化卵的滞育性，实现一年多次养蚕，满足科研、生产的需求。本研究则探讨了用DH处理适当化蛹时间的无滞育期多化性蚕蛹，使其产生滞育卵，从而减少养蚕次数、降低品种保存风险和成本的方法。实验结果表明：在化蛹后24 h至120 h之间，用1 μg、2 μg的 DH处理都能产生有效的滞育卵，而蚕蛹注射DH的最佳时间是化蛹后的24～86 h，每个蚕蛹注射DH的最佳剂量是2 μg。至于试验时不选用24 h前的蚕蛹进行注射试验，主要是因为此时的蚕蛹很嫩，极易碰破皮肤或造成注射后伤口感染而导致死蛹，虽然该时段注射DH后也有可能产生较多滞育卵，但也不建议在此阶段进行DH注射。化蛹149 h之后，无论用多大剂量的DH处理蚕蛹，均不能产生滞育卵。可能是由于此时蛹期经过时间已过半，卵母细胞已进入晚期生长阶段，其滞育与否也已决定，外界因素无法再改变。

经滞育激素处理的无滞育期多化性品种所产的卵，其滞育性不具遗传性，后代均能恢复无滞育期多化性的特征，因为没有改变其遗传物质(DNA)，所以不必担心其化性或形态特征、经济性状的改变，是安全有效的减少养蚕次数、降低品种保存成本的方法。我们选择在最后一期蚕(晚秋)进行，主要是让无滞育期多化性品种充分保持其固有的多化性特征，适当减少2～3个饲养世代数。至于经处理的滞育卵在2.5 ℃的条件下冷藏40 d，按冷藏浸酸的标准处理解除滞育后，蚁蚕的孵化率低及孵化不够整齐的原因，认为可能是蚕卵的冷藏天数不足，滞育尚未完全解除所致。

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