崔天盆 郑承红 陈 杰 苏斌涛(武汉市第一医院临床免疫学实验室，武汉 430022)

细胞死亡可根据其表观形态学分为:细胞凋亡、坏死、细胞自噬等;也可根据有无核酸酶或不同类别的蛋白酶的参与分为:半胱天冬酶参与的细胞死亡，钙激活中性蛋白酶参与的细胞死亡，组织蛋白酶和谷氨酰胺转胺酶参与的细胞死亡;还可以根据功能方面分为:程序性的细胞死亡，意外的细胞死亡，生理性的细胞死亡或病理性的细胞死亡;或者根据免疫学特性分为:免疫原性的细胞死亡或无免疫原性的细胞死亡。2009年细胞死亡命名委员会(Nomenclature Committee on Cell Death，NCCD)［1］建议统一根据形态学标准定义和分类细胞死亡，目前发现细胞死亡种类有凋亡(Apoptosis)、自噬性细胞死亡(Autophagic cell death)、坏死(Necrosis)、角化性细胞死亡(Cornification)、非典型细胞死亡，包括有丝分裂崩溃(Mitotic catastrophe)、失巢凋亡(Anoikis)、沃勒变性(Wallerian degeneration)、副凋亡(Paraptosis)、细胞焦亡(Pyroptosis)、内 亡(Entosis)、兴奋性中毒(Excitotoxicity)、铁死亡(Ferroptosis)。死亡细胞的有效清除对一个有机体的存活是必要的。正在死亡的或者已经死亡细胞的通过吞噬作用清除，根据不同的细胞死亡模式即凋亡、自噬和坏死，存在不同的机制来保证细胞残骸的清除。

1 细胞死亡种类

1.1 凋亡 细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主、有序的死亡方式。凋亡细胞膜发生皱缩、凹陷，染色质固缩，最后核碎片，很少或根本没有细胞器超微结构改变，细胞膜将细胞质分割包围，有些包围了染色质片段，形成多个膜结构尚完整的泡状小体，称为凋亡小体。由于介绍文献很多，本文不再累述。

1.2 自噬和自噬性细胞死亡 1962年Ashford和Porter在实验中发现自食(self-eating)现象［2］，比利时细胞学家和生物化学家、1974年诺贝尔生理学和医学奖获得者 De Duve在1963年提出自噬(Autophagy)的概念［3］。自噬发生在生理状态下，参与细胞的基本生理过程，但是也可由不同应激所引发，自噬活性可成倍增加。自噬在细胞重塑、清除受损的或多余的细胞器、维持细胞动态平衡等过程中扮演重要角色，但是细胞利用自噬机制降解外来和自身物质的识别机制还不清楚。自噬按其发生的方式不同，可以分为大自噬(Macroautophagy)、小自噬(Microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(Chaperonee-mediated autophagy)。

自噬是细胞内物质利用溶酶体被降解的总称，它是真核细胞所特有的。细胞内的物质主要有两种降解途径，一种通过蛋白酶体被降解，另一种通过自噬作用。蛋白酶体主要降解胞内短寿命蛋白，而自噬负责长寿命蛋白和一些细胞器的降解。虽然毫无疑问，自噬促进细胞存活，在多种生理情况和实验中观察到死亡诱导刺激撤出后“自噬性细胞死亡”仍然可以恢复细胞活性。自噬性细胞死亡的定义:细胞死亡过程中不发生染色质凝集，但伴随着胞内出现大量自噬空泡(Autophagic vaculization，AV)。与凋亡的细胞不同，在体内发生的自噬性细胞死亡很少或没有吞噬细胞参与清除。

1.3 坏死 坏死(Necrosis)定义为细胞死亡过程中伴随细胞体积增大(Oncosis)，细胞器肿胀，质膜破裂，细胞内成分丢失。很长一段时间，坏死一直被认为是一种不可控的非程序性细胞死亡机制，但是现在认为部分类型的细胞坏死是可以被信号传导通路所控制。例如，死亡域受体(如 TNFR1、Fas/CD95和TRAIL-R)和Toll样受体(例如TLR3和TLR4)已被证明引起坏死，特别是在半胱天冬酶抑制剂的存在的条件下，这些分子介导的细胞死亡依赖于RIP1激酶。

程序性细胞坏死机制研究得不是很清楚，如下细胞器和小分子与细胞坏死过程相关。线粒体改变:解偶联、产生活性氧、一氧化氮和线粒体膜通透性改变;溶酶体的变化:ROS、溶酶体膜通透性改变;细胞核变化:过度活跃PARP-1和随之而来的水解的NAD+;脂质降解:激活后磷脂酶、脂氧合酶和鞘磷脂;增加胞浆钙离子(Ca2++)的浓度，导致线粒体过载和激活钙激活中性蛋白酶、组织蛋白酶［4］。

1.4 角化性细胞死亡 组织学上角化(Cornification)是鳞状表皮组织形成表皮屏障的过程。在细胞水平，角化性细胞死亡(Cornification)是发生在表皮程序性细胞死亡的一个非常具体的形式，形态和生化特征与凋亡明显不同。角化伴随角蛋白L、兜甲蛋白(Loricrin)、富脯氨酸蛋白(Small proline-rich proteins)和外皮蛋白(involucrin)和脂类——例如脂肪酸和ω-羟基神经酰胺，这些是皮肤角化层的功能的产生。角化过程中，类似于其他脱核的组织——晶状体上皮细胞和成熟红细胞，细胞核和细胞器消失，在终末阶段，细胞代谢停滞，细胞完全被角蛋白和较大的角蛋白中间纤维充斥。与角质细胞不同，无论是成熟红细胞和还是晶状体上皮细胞在一定条件下不导致细胞死亡，角化被视为一个真正的细胞死亡程序。在分子水平上，角化是上皮细胞分化在外部环境和内部酶和底物相互作用下形成的。通过交联的酶如钙依赖性转谷氨酰胺酶-1、3、5(Transglutaminase)作用于多个底物(例如兜甲蛋白，富脯氨酸蛋白，套膜蛋白和SP100)，以及通过特殊脂类的合成并被释放到细胞外基质和蛋白酶［1，5］。

1.5 非典型细胞死亡方式

1.5.1 有丝分裂崩溃 细胞周期是由一系列连续事件按精确的时间顺序进行的动态过程，受到DNA损伤检查点和纺锤体组装检查点等细胞周期检查点的精密调控。当DNA受到损伤或纺锤体结构破坏，细胞会通过一系列的信号通路激活细胞周期检查点，使细胞周期停滞，对DNA损伤进行修复，如果损伤太大无法修复，细胞便启动死亡通路，导致细胞有丝分裂崩溃(Mitotic catastrophe)［1，6］。

有丝分裂崩溃是一种细胞死亡模式，在有丝分裂期间或之后不久发生的有丝分裂异常状态，可伴有形态学改变，包括微核和多核(胞质分裂缺陷导致存在两个或两个以上相似或异构的核)。然而并没有将这一广泛使用的术语达成共识，有丝分裂崩溃可导致细胞凋亡、坏死和衰老。细胞有丝分裂崩溃是由多种分子调控的过程，其死亡信号传递有很大一部分与凋亡相重叠。在发生机制上，PI3K/AKT、CDK1、P53及生存素等参与有丝分裂崩溃的调控。

1.5.2 失巢凋亡 失巢凋亡(Anoikis)，一种特殊的细胞程序性死亡，是由于细胞与细胞外基质或相邻细胞脱离接触而诱发的。失巢凋亡作为一种特殊的程序化细胞死亡形式，在机体发育、组织自身平衡、疾病发生和肿瘤转移中起重要作用。由于历史文献库相当量的文献使用失巢凋亡一词，NCDD建议保留。失巢凋亡通过传统的细胞凋亡途径诱导细胞死亡。整合蛋白感知和传导细胞外基质信号而控制细胞的黏附和存活，Bcl-2和某些Bcl-2相关蛋白广泛参与细胞失巢凋亡的调节，多种蛋白激酶信号分子参与失巢凋亡的信号转导［7］。

1.5.3 沃勒变性 沃勒变性(Wallerian degeneration)是发生在神经系统中的一种少见形式的细胞自食，其特征主要在于细胞的分解代谢，如，一个神经元轴突发生部分退化，但并不影响神经元胞体。沃勒变性并不是严格意义上的细胞死亡，因为沃勒变性神经元仍然未死，只是轴突变性死亡［8］。

1.5.4 副凋亡(Paraptosis) 副凋亡(Paraptosis)这个术语最初是用来描述形态和PCD的一种形式，是Ⅲ型程序性细胞死亡中的典型代表。副凋亡典型特征是由线粒体和内质网肿胀造成的胞浆空泡化。与坏死不同的是，副凋亡并不出现细胞膜的破坏。副凋亡由胰岛素样生长因子受体1的表达所激发，线粒体和内质网肿胀造成的胞浆空泡化，但是没有凋亡的其他形态特征。半胱天冬酶抑制剂和过表达抗凋亡蛋白BCL2-XL不能抑制副凋亡，副凋亡TUNEL阴性。可能是丝裂原活化蛋白激酶的成员介导副凋亡发生。副凋亡与凋亡也有一些共同点，如细胞膜表面磷脂酰丝氨酸外翻、线粒体跨膜电位下降［1，4］。

1.5.5 细胞焦亡 首先在感染沙门氏菌巨噬细胞时发现细胞焦亡(Pyroptosis)，它涉及半胱天冬酶-1而不是半胱天冬酶-3的活化，半胱天冬酶-1被称为白细胞介素-1β(IL-1β)的转化酶。伤寒沙门氏菌(和其他病原体，如绿脓杆菌和志贺氏菌福氏志贺菌)通过IPAF——一种Apaf-1相关NLR蛋白，诱导胱天蛋白酶-1的活化;炭疽芽孢杆菌致死毒素通过Nalp1诱发IPAF，不需要Apaf-1。此外，脂多糖处理的巨噬细胞经过细胞焦亡的接头蛋白介导的ASC，ASC与胱天蛋白酶-1一起形成超分子的细胞质复合体——细胞焦亡体(Pyroptosome)。因此，不同的途径诱导胱天蛋白酶-1活化导致细胞焦亡。这种细胞死亡形式导致释放的IL-1β(这是一个主要发热诱导细胞因子或热原)和IL-18可能会起到相应的局部和全身炎症反应。巨噬细胞焦亡无细胞凋亡形态特征，但是显示了一些坏死相关性状［9］。

1.5.6 内亡 内亡(Entosis)或叫侵入性细胞死亡最初描述亨廷顿氏病患者细胞自相残杀的一种形式，是一个新的细胞死亡方式，其中一个细胞吞噬另一个活细胞，被吞噬细胞最后死于吞噬小体。在侵入性死亡过程中，细胞通过钙黏着蛋白介导的细胞间连接作用，经内化过程侵入临近的宿主细胞空泡内，被溶胞体酶系降解而导致死亡。细胞侵入性死亡可能在抑制肿瘤细胞的增殖中发挥作用，并已在乳腺癌细胞中得到初步证实。细胞侵入性死亡最有效的细胞模型是MCF-7乳腺癌细胞，MCF-7既无半胱天冬酶-1也无Beclin-1，因此是凋亡和自噬无能细胞。细胞侵入性死亡既不被 BCL-2也不被ZVAD-fmk所抑制，内吞细胞最初是活的，随后被溶胞体酶系降解而导致死亡［10］。

1.5.7 兴奋性中毒 兴奋性中毒(Excitotoxicity)是神经元死亡的一种形式，神经元受到兴奋性氨基酸如谷氨酸的刺激，导致N-甲基-D-天门冬氨酸钙离子渗透通道的开放，导致胞内钙超载和死亡信号激活，兴奋性中毒的信号与细胞凋亡和坏死信号重叠，MMP的参与是其关键点，一氧化氮参与信号转导。兴奋性中毒不能被认为是作为一个单独的细胞死亡方式［11］。

1.5.8 铁死亡 2012年，Dixon等［12］提出了一种叫做铁死亡(Ferroptosis)的铁依赖性的细胞死亡形式，该死亡方式受细胞内信号通路的严密调节，铁死亡典型的特征为线粒体变小，但双层膜的密度增加，同时表现为细胞质以及脂质活性氧自由基增多。用erastin孵育N-RAS基因突变的人纤维肉瘤细胞系HT-1080细胞，研究发现，细胞的ROS和死亡率增加，同时加入去铁胺共孵育降低了细胞ROS聚集和细胞死亡。铁死亡与RAS肿瘤细胞的死亡和神经退行性疾病的发生有密切关系。

2 细胞死亡的清除

凋亡和坏死通过不同的机制来保证细胞残骸的清除，如不能有效清除，就会导致组织结构紊乱，血管栓塞，引起炎症和自身免疫反应。临床上系统性红斑狼疮、慢性阻塞性肺疾病、动脉粥样硬化等均存在凋亡和坏死细胞清除障碍。由于死亡细胞的清除研究刚刚起步，研究较多的是凋亡和坏死细胞的清除，故此文重点介绍这两方面。

2.1 凋亡细胞的清除 过去十五年凋亡的分子机制的阐明较充分，但是凋亡细胞碎片的清除机制研究较少。凋亡的细胞或者凋亡小体最初是被完整的质膜包裹的，如果它们不能在短的时间内被清除，它们将继发坏死，释放有免疫原性的细胞内成分到细胞外。在实体器官，死亡的细胞在大多数情况下由邻近的细胞吞噬清除。

众所周知，在凋亡的过程中新的分子会出现在细胞的表面。最熟知的就是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜的内表面进入外表面。PS对巨噬细胞识别和吞噬的重要性首先发现于红细胞，衰老的红细胞清除跟凋亡细胞类似，依赖Fas-半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-8信号导致的PS外翻;还有N-乙酰葡萄糖胺和岩藻糖的表达增加。这些变化累积成一个对吞噬细胞来说代表强烈的“吃我”信号的凋亡特异性的表面模式。吞噬细胞必须被凋亡细胞分泌的所谓的“找我”信号像溶血磷脂(LPC)所趋化。在炎症过程中释放的潜在的“找我”信号或者介质，是膜联蛋白Ⅰ和/或者脂氧素。

吞噬就是摄入大小超过0.5 μm颗粒。在这个过程中，巨噬细胞通过细胞骨架重排包围即将被消化的颗粒，形成一个所谓的吞噬环。环绕颗粒完成后，颗粒就被包埋在质膜小囊中，形成了吞噬小体，随后它成熟为吞噬溶酶体。

大多数关于凋亡细胞被巨噬细胞吞噬后的免疫学结局是没有炎症反应或者一个已经存在的促炎反应在吞噬发生后被下调。巨噬细胞消化凋亡细胞后的抗炎效应的发挥主要是分泌及上调TGF-β，血小板活化因子，IL-10和前列腺素E2。许多研究揭示未成熟的树突状细胞(iDCs)在消化凋亡的细胞后并不能成熟为向T细胞提呈自身抗原的抗原提呈细胞［13，14］。

2.2 坏死细胞和细胞碎片的清除 原发性的或者继发性的坏死细胞的最终去处:(1)调理坏死细胞及其细胞碎片像凋亡细胞样被清除;(2)坏死的细胞碎片被细胞外的蛋白水解酶和核酶水解消化，随后降解的大分子被重吸收。已经证实的是坏死的细胞也能通过吞噬移除。与凋亡细胞不同，坏死细胞经历了胞膜的破坏被裂解后导致细胞成分扩散进入细胞外间隙，这样使巨噬细胞很难收集碎片。与凋亡的细胞相比，坏死的细胞的吞噬不是那么有效，而且发生较晚。坏死细胞吞噬的机制被认为是巨胞饮作用，胞膜完整与否不重要。巨噬细胞形成广泛的膜皱褶最后形成一个长的细的突起，后者蜿蜒包裹坏死的碎片，促使坏死细胞碎片与细胞外液体一起在巨胞饮体中被消化。而凋亡细胞被消化是通过吞噬过程中拉链样的机制，这个过程的发生需要一个未受损的质膜的存在［13-15］。

坏死细胞被吞噬后的免疫结果与凋亡细胞不同，坏死细胞的摄入仅能增强但是不能有效诱导巨噬细胞的活化。坏死裂解的中性粒细胞诱导促炎反应，通过释放巨噬细胞炎症蛋白2(Macrophageinflammatory protein-2)。在坏死中性粒细胞细胞摄取过程中，从坏死中性粒细胞释放的丝氨酸蛋白酶弹性蛋白酶作为一个促炎危险信号。高迁移率族蛋白1(HMGB1)被认为作为一个危险信号，它的炎症效应不仅是由于作为趋化因子的作用，也是由于它诱导促炎细胞因子的能力。热休克蛋白Hsp72是另一个危险信号因子，与LPS单独作用相比，Hsp72与LPS协同刺激巨噬细胞产生一个更强的细胞因子反应。几个比较坏死细胞与凋亡细胞被iDCs吞噬的研究揭示:与凋亡细胞不同，原发性和继发性坏死细胞的消化导致iDCs的成熟，表达迁移到次级淋巴器官所需的趋化因子受体，有效地将抗原提呈到CD4+和CD8+的T细胞。

2.3 与坏死细胞清除有关的细胞外机制 坏死细胞碎片清除的第二个主要方式是细胞外酶促进清除，随后巨分子被吞噬细胞重吸收。促进水解的酶包括出现在循环和细胞外液中核酶和水解酶系统(凝血和纤溶系统)，或者由募集来的活化的吞噬细胞分泌的酶。此外，通过细胞自身释放的溶酶体酶自溶可能在某些情况下也起作用。

体外实验证实与凋亡细胞相比，坏死细胞的清除发生较晚，因为膜破裂后，细胞内成分是自由流动的，巨噬细胞很难收集坏死细胞碎片。血浆内源性核酶DNA酶Ⅰ和纤溶酶原系统成分能穿透坏死细胞，在细胞和核结构的纤溶酶原被纤溶酶原活化因子活化后，纤溶酶原被转化活化的丝氨酸蛋白酶-纤溶酶。纤溶酶降解染色质的结构性蛋白如组蛋白，促进DNA酶Ⅰ降解染色质。C1q可以结合DNA，也能穿透坏死细胞，去结合核成分。C1q能促进染色质被血清DNA酶Ⅰ的降解。还有，C1q可调理坏死细胞来源的核和染色质被巨噬细胞摄取［16］。

最后，一个好的细胞死亡命名法只有当它能预测药理学或者基因调节的细胞死亡，或者能预测活体内的细胞死亡，这种细胞死亡命名法才被认为是有用的，因此目前的形态学命名法有一定局限性［1］。死亡细胞的有效清除对一个有机体的存活是必要的。正在死亡的或者已经死亡细胞通过吞噬作用清除，随后通过水解酶完成细胞内的降解，根据细胞死亡模式:凋亡、自噬和坏死，存在不同的机制来保证细胞残骸的清除。在PCD的过程中，小的易消化的细胞残骸可以被迅速和有效的吞噬，由于坏死细胞的细胞膜完整性的缺乏和细胞膜破裂后细胞内容物的播散，坏死细胞碎片的清除经常被推迟。细胞外的机制(水解酶、细胞巨分子的调理吞噬)是经典的细胞吞噬作用的补充。其他非典型死亡清除研究较少，有待今后的进一步研究。

［1］Kroemer G，Galluzzi L，Vandenabeele P，et al.Classification of cell death:recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death［J］.Cell Death Differ，2009，16(1):3-11.

［2］Ashford TP，Porter KR.Cytoplasmic components in hepatic cell lysosomes［J］.J Cell Biol，1962，12:198-202.

［3］DE Duvec.The lysosome［J］.Sci Am，1963，208:64-72.

［4］Martin SJ，Henry CM.Distinguishing between apoptosis，necrosis，necroptosis and other cell death modalities［J］.Methods，2013，61(2):87-89.

［5］Candi E，Schmidt R，Melino G.The cornified envelope:a model of cell death in the skin［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2005，6(4):328-340.

［6］Gardner MK，Zanic M，Howard J.Microtubule catastrophe and rescue［J］.Curr Opin Cell Biol，2013，25(1):14-22.

［7］Bertrand K.Survival of exfoliated epithelial cells:a delicate balance between anoikis and apoptosis［J］.Biomed Biotechnol，2011，2011:534139.

［8］Lingor P，Koch JC，Tönges L，et al.Axonal degeneration as a therapeutic target in the CNS［J］.Cell Tissue Res，2012，349(1):289-311.

［9］von Moltke J，Ayres JS，Kofoed EM，et al.Recognition of bacteria by inflammasomes［J］.Annu Rev Immunol，2013，31:73-106.

［10］Krajcovic M，Overholtzer M.Mechanisms of ploidy increase in human cancers:a new role for cell cannibalism［J］.Cancer Res，2012，72(7):1596-1601.

［11］Mehta A，Prabhakar M，Kumar P，et al.Excitotoxicity:bridge to various triggers in neurodegenerative disorders［J］.Eur J Pharmacol，2013，698(1-3):6-18.

［12］Dixon SJ，Lemberg KM，Lamprecht MR，et al.Ferroptosis:an irondependent form of nonapoptotic cell death［J］.Cell，2012，149(5):1060-1072.

［13］Markus N，Hans GM.Molecules involved in recognition and clearance of apoptotic/necrotic cells and cell debris.See，Dmitri VK，Peter V Edit.Phagocytosis of Dying Cells:From Molecular Mechanisms to Human Disease［M］.Springer Science+Business Media B.V，2009:103-144.

［14］Rossi AG.Apoptosis，apoptotic cell clearance and resolution of inflammation［J］.Presse Med，2013，42(4 Pt 2):536-537.

［15］Martinet W，Schrijvers DM，De Meyer GR.Necrotic cell death in atherosclerosis［J］.Basic Res Cardiol，2011，106(5):749-760.

［16］Gullstrand B，Mårtensson U，Sturfelt G，et al.Complement classical pathway components are all important in clearance of apoptotic and secondary necrotic cells［J］.Clin Exp Immunol，2009，156(2):303-311.