郭 瑢 综述 张 瑾 审校

·综 述·

Notch信号通路在乳腺癌干细胞中的研究进展*

郭 瑢 综述 张 瑾 审校

乳腺癌干细胞是一群具有自我更新及多向分化潜能的细胞，在乳腺癌的发生、发展以及转移、复发中起着极其重要的作用。正常情况下，乳腺干细胞的分化、更新能力受相关信号转导通路的严格调控，当这些信号通路发生异常干细胞将会异常分化，形成乳腺癌干细胞，并无限增殖形成肿瘤。随着人们对乳腺癌干细胞的深入研究，Notch信号通路与其他信号通路的相互作用对乳腺癌干细胞的调控逐渐被人们所重视。本文为进一步了解Notch信号通路在乳腺癌的发生、发展以及靶向治疗中的重要意义，结合乳腺癌干细胞信号通路的最新研究进展进行综述。

Notch 信号通路 乳腺癌 乳腺癌干细胞 靶向治疗

Notch基因最早于1917年由Tomas Hunt Morgan在果蝇中发现，因其功能部分缺失使果蝇翅膀的边缘造成切迹而命名。Notch信号通路是一条影响细胞命运的重要通路，Notch受体通过与邻近细胞表达的配体直接接触而被激活，调控细胞的增殖、分化和凋亡［1］。Notch信号异常在乳腺癌的发生、发展中起到了重要作用，对乳腺癌干细胞的调控受到广泛的关注［2］。另外，Notch信号通路与其他信号通路间存在密切的相互作用，针对Notch信号通路的靶向药物将给乳腺癌的治疗带来新的方向［3］。本文旨在回顾近年来Notch信号通路的相关研究，探索Notch信号通路以及其相关因子对乳腺癌干细胞的影响，揭示其与肿瘤形成的关系，为基于Notch信号通路治疗乳腺癌提供理论依据。

1 Notch信号通路的组成及其活化

1.1 Notch信号通路的组成

Notch信号通路由Notch受体、Notch配体及细胞内效应器分子CSL DNA结合蛋白3部分组成。Notch受体属于单次跨膜蛋白家族，在哺乳动物中共发现4类Notch基因，编码4种Notch受体，分别为Notch 1～4。由Notch胞外区（Notch extracellular domain，NEC）、Notch跨膜区（Notch trans-membrane domain，NTM）和Notch胞内区（Notch intracellular domain，NICD）3个部分组成。Notch配体，即Delta/Serrate/LAG2（DSL）家族，又被称为DSL蛋白。至目前在哺乳动物中发现5种配体：Delta-like1、3和4（DLL1、DLL3、DLL4）以及Jagged1、Jagged 2。细胞内效应器分子，即CSL DNA结合蛋白，是CBF-1/Suppresor of Hairless/LAG1的合称，在哺乳动物中称为RBP-Jκ（recombination signal binding protein-Jκ），为Notch信号通路中起关键作用的转录调节因子。

1.2 Notch信号通路的活化

CBF-1/RBP-Jκ依赖途径是经典的Notch信号通路。Notch信号转导在活化过程中经3次裂解：Notch受体在内质网中合成无活性的单肽，在高尔基体内的furin样转化酶作用下，在裂解点S1发生第1次裂解，形成活化的异二聚体形式的Notch受体，包括胞外区和跨膜片段2个亚基。受体与配体结合后，在解聚素和金属蛋白酶/肿瘤坏死因子-α转换酶作用下发生第2次裂解（裂解点S2），N端裂解产物（胞外区）被配体表达细胞吞噬，而C端裂解产物进一步在跨膜区的第3个裂解点S3，经γ-分泌酶复合体裂解，释放Notch受体的活化形式NICD［1-3］。NICD进入细胞核，结合CSL蛋白并募集核转录激活蛋白家族MAML（mastermind-like family members），形成三元络合转录激活物（NICD-CSL-MAML），从而激活靶基因的转录。Notch靶基因转录编码包括Hes与Hey在内的碱性螺旋-环-螺旋（basic-helix-loop-helix）家族转录因子，这些转录因子促进下游基因的表达，从而促进细胞增殖、抑制细胞分化［2］。

1.3 乳腺癌干细胞中Notch的活化

乳腺癌干细胞中Notch信号通路的活性成为乳腺癌干细胞最近的研究热点。乳腺癌干细胞中Notch的表达可以启动具有CD44+/CD24-表面标志的细胞群，这与肿瘤的发生以及高侵袭性密切相关，而Notch受体抑制剂可以降低乳腺癌干细胞微球体形成率。

Notch1与乳腺癌干细胞的自我更新有关。Notch1胞内区的激活能够促进乳腺癌干细胞的自我更新，沉默Notch1相反将导致乳腺癌干细胞及乳腺癌细胞生长停滞并促进其凋亡。最近的研究再次证实，沉默Notch1后乳腺癌干细胞微球体的形成减少，细胞的运动侵袭能力下降，小鼠体内肿瘤形成能力下降，表明Notch1与乳腺癌干细胞的恶性行为密切相关［4］。Notch1主要在正常乳腺表面导管上皮（Luminal）A细胞中表达，而Notch4主要存在于乳腺基底导管上皮（Basal-like）B细胞中以及乳腺癌干细胞（breast cancer stem cells，BCSC）富集的群体中，表明Notch1及Notch4通过影响BCSC中不同亚群的细胞产生不同作用，抑制Notch1活性，仅在一定程度上减少了乳腺微球体形成单位（mammosphere forming units，MFUs）并抑制肿瘤的形成，而Notch4基因的敲降引起MFUs的显著抑制［5］。

Notch2与Notch3也与BCSC有关。最近的研究发现，位于1p11.2区域的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）rs11249433为ER阳性乳腺癌新的危险因子，而Notch2表达在携带有危险基因型（AG/GG）的rs11249433中明显增高，Notch2在ER阳性Luminal型乳腺癌干细胞的分化中起关键作用，携带rs11249433的肿瘤中Notch2表达的增加促进ER阳性Luminal型肿瘤的形成［6］。在体外实验中，Notch3表达在人类祖细胞向Luminal细胞的分化过程中起到重要作用，并且Notch3受体表达的升高与具有高侵袭性的三阴性乳腺癌有关［7］。另有研究表明Notch3高表达的乳腺癌中含有较高比例的乳腺癌干细胞，其相关性依赖于细胞周期蛋白D1的正常表达［8］。

2 Notch信号通路与乳腺癌干细胞其他信号通路

Notch信号通路与其他信号通路、生长因子、细胞因子、致癌激酶以及转录因子间存在广泛的联系，包括Hedgehog、Wnt信号通路以及PI3K/AKT/mTOR信号通路等，共同调控乳腺癌干细胞的生物学行为［3］。

2.1 Hedgehog信号通路

Notch与Hedgehog信号通路均与乳腺癌细胞的自我更新及分化有关，Hedgehog信号通路已被证实能够诱导Notch配体Jagged2表达；使用shRNA沉默Notch2及Gli1或Gli2，使Notch及Hedgehog信号通路同时抑制，能够降低肿瘤细胞集落形成率，但单独使用其中任意一种shRNA作用均无明显效果［9］。另外，Hes1介导Notch导致的Gli1转录抑制，从而负性调节Hedgehog，抑制Notch信号通路将导致Hedgehog通路活性的上调，联合多通路的靶向治疗相对于单一治疗更为有效［10］。

2.2 Wnt信号通路

研究发现，在人类乳腺上皮细胞中Wnt1表达的升高导致一系列Notch信号通路相关因子的激活，Wnt靶基因Lef1与Axin2表达的上调同时伴随着Notch配体DLL3、DLL4表达增加；相反，阻抑Notch配体表达能够消除Wnt1介导的乳腺上皮细胞转化，这些结果均表明Notch与Wnt间的平衡对于乳腺癌的发生至关重要［11］。然而，Notch与Wnt在影响干细胞命运的过程中具有相反的效应，Notch促进干细胞分化，而Wnt促进其自我更新与增殖。最近的研究表明，在一些实体肿瘤中Notch也存在潜在的肿瘤抑制作用，这可能与Notch抑制Wnt信号通路的致癌性有关［12］。

2.3 PI3K/AKT/mTOR信号通路

在乳腺上皮细胞中，Notch已被证实能够调节AKT通路，Notch1通过Hes1转录沉默PTEN，从而诱导PI3K/AKT通路的上调［13］。AKT的激活是Notch导致凋亡抑制的必要条件；相反，在乳腺癌细胞中抑制Notch通路将导致AKT活性，降低并促进凋亡［13］。mTOR（molecular target of rapamycin）是一个关键的蛋白激酶，通常作为PI3K/AKT信号通路的下游因子。使用γ-分泌酶抑制剂抑制Notch信号通路，将导致Notch以及mTOR通路的同时抑制，降低细胞增殖能力，从而达到抗肿瘤活性［14］。最近的研究表明，在三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）中Notch1、pAKT及NF-κB有显著相关性，AKT能够介导Notch1对NF-κB的激活作用，从而导致TNBC的增殖、侵袭与转移，针对这3条通路的联合治疗为TNBC提供了新的治疗途径［15］。

3 Notch信号通路的临床应用

传统的乳腺癌治疗仅针对于杀伤癌细胞，而对于具有强大自我更新能力及肿瘤形成能力的乳腺癌干细胞无明显作用。Notch信号通路影响乳腺癌干细胞的命运，因此针对Notch的靶向药物，包括γ-分泌酶抑制剂（γ-secretase inhibitors，GSIs）以及大分子单克隆抗体（mAbs），受到越来越多的关注，并向临床应用方向迅速发展。

3.1 γ-分泌酶抑制剂

如前所述，Notch受体激活过程中的第3次裂解需要γ-分泌酶的催化，从而释放Notch受体的活化形式。GSIs通过竞争性结合γ-分泌酶裂解位点抑制Notch的活性，针对乳腺癌细胞的GSIs目前有3种。

3.1.1 PF-03084014 PF-03084014能够显著抑制γ-分泌酶的活性，从而下调Notch信号通路，而对γ-分泌酶及其配体的表达无影响［16］。体外实验中PF-03084014抑制癌细胞运动、内皮细胞形成以及微球体形成；体内实验中，PF-03084014导致细胞凋亡、抑制乳腺移植瘤的增殖能力与自我更新能力、导致肿瘤血管损伤以及转移活性的降低［16］。另外，乳腺癌动物模型研究发现PF-03084014与多西他赛具有协同作用，其作用机制为逆转多西他赛造成的NICD上调以及NUMB（NICD的负性调控因子）的表达抑制，从而抑制多西他赛造成的Notch信号通路的激活，同时，PF-03084014能够逆转多西他赛引起的上皮间质转化从而减少CSCs［17］。

3.1.2 MK-0752 MK-0752（MERK）是一种强效非竞争性口服GSIs，Ⅰ期临床试验证实MK-0752在实体肿瘤中能够带来临床获益，并且其毒性可以耐受［18］。最近的研究表明，MK-0752与多西他赛联合用于局部进展或转移性乳腺癌，多周期治疗后，组织学检查发现CD44+/CD24-、ALDH+乳腺癌干细胞以及微球体形成显著减少［19］。该研究抑制乳腺癌干细胞自我更新与分化，治疗乳腺癌有效，奠定了Notch靶向治疗联合化疗的基础。

3.1.3 RO-4929097 在三阴性乳腺癌中，BCSC被认为与肿瘤耐药及复发有关，而BCSC中存在Notch信号通路的异常激活，从而使三阴性乳腺癌高表达Notch［15，20］。因此，针对Notch信号通路的靶向治疗成为三阴性乳腺癌新的治疗方向［7］。但最近的研究发现，RO-4929097明显抑制三阴性乳腺癌的BCSC中CD44+/CD24low亚群细胞的微球体形成及异种移植瘤的生长，而CD44+/CD24neg细胞群则对RO-4929097耐药［21］。RO-4929097有望用于对抗BCSC，但干细胞的异质性将限制其效能。

3.2 Notch信号通路单克隆抗体

另一类Notch信号通路的靶向抑制剂为Notch单克隆抗体，具有较强特异性，有望避免GSIs引起的非特异性Notch受体及其下游抑制导致的相关毒性。目前进入临床试验的Notch单克隆抗体为OMP-21M18、OMP-59R5及OMP52M51。OMP-21M18为DLL4抗体，阻止DLL4与Notch1、Notch4的结合。研究证实，抑制DLL4的单克隆抗体，单药或联合伊立替康均可减少乳腺癌干细胞比率，从而抑制肿瘤的形成［22］。OMP-59R5为选择性的结合Notch2、Notch3受体，从而阻断Notch信号通路。OMP52M51为选择性抑制Notch1受体，可以抑制细胞生长及血管生成。

4 结语

综上所述，Notch信号通路对乳腺癌干细胞的调控作用已受到广泛关注，然而对其确切作用机制尚需展开更深入的研究。同时，Notch信号通路与其他乳腺癌干细胞调控因子间的相互作用仍需进一步探索，以发挥其在乳腺癌治疗方面广阔的应用前景。然而，GSIs以及单克隆抗体的安全性与有效性有待进一步验证，减轻其毒性的策略亟需不断完善。另外，特异性识别Notch受体的小干扰RNA也逐渐被证实能够有效抑制乳腺癌干细胞，这也将成为研究Notch信号通路的又一热点。总之，Notch通路抑制剂与其他治疗手段，包括针对其他因子的靶向治疗、细胞毒性药物治疗、放疗、生物治疗等抗肿瘤综合治疗，有望给Notch靶向治疗乳腺癌患者带来更加广阔的前景。

1 Artavanis-Tsakonas S,Rand MD,Lake RJ.Notch signaling：cell fate control and signal integration in development[J].Science,1999, 284(5415)：770-776.

2 Takebe N,Nguyen D,Yang SX.Targeting notch signaling pathway in cancer：clinical development advances and challenges[J]. Pharmacol Ther,2014,141(2)：140-149.

3 Guo S,Liu M,Gonzalez-Perez RR.Role of Notch and its oncogenic signaling crosstalk in breast cancer[J].Biochim Biophys Acta, 2011,1815(2)：197-213.

4 Peng GL,Tian Y,Lu C,et al.Effects of notch-1 down-regulation on malignant behaviors of breast cancer stem cells[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2014,34(2)：195-200.

5 Harrison H,Farnie G,Howell SJ,et al.Regulation of breast cancer stem cell activity by signaling through the Notch4 receptor[J].Cancer Res,2010,70(2)：709-718.

6 Fu YP,Edvardsen H,Kaushiva A,et al.Notch2 in breast cancer：association of SNP rs11249433 with gene expression in ER-positive breast tumors without TP53 mutations[J].Mol Cancer,2010,9：113.

7 Lafkas D,Rodilla V,Huyghe M,et al.Notch3 marks clonogenic mammary luminal progenitor cells in vivo[J].J Cell Biol,2013,203 (1)：47-56.

8 Ling H,Sylvestre JR,Jolicoeur P.Cyclin D1-dependent induction of luminal inflammatory breast tumors by activated notch3[J].Cancer Res,2013,73(19)：5963-5973.

9 Brechbiel J,Miller-Moslin K,Adjei AA.Crosstalk between hedgehog and other signaling pathways as a basis for combination therapies in cancer[J].Cancer Treat Rev,2014,40(6)750-759.

10 Schreck KC,Taylor P,Marchionni L,et al.The Notch target Hes1 directly modulates Gli1 expression and Hedgehog signaling：a potential mechanism of therapeutic resistance[J].Clin Cancer Res,2010,16(24)：6060-6070.

11 Ayyanan A,Civenni G,Ciarloni L,et al.Increased Wnt signaling triggers oncogenic conversion of human breast epithelial cells by a Notch-dependent mechanism[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006, 103(10)：3799-3804.

12 Lobry C,Oh P,Aifantis I.Oncogenic and tumor suppressor functions of Notch in cancer：it's NOTCH what you think[J].J Exp Med,2011,208(10)：1931-1935.

13 Meurette O,Stylianou S,Rock R,et al.Notch activation induces Akt signaling via an autocrine loop to prevent apoptosis in breast epithelial cells[J].Cancer Res,2009,69(12)：5015-5022.

14 Efferson CL,Winkelmann CT,Ware C,et al.Downregulation of Notch pathway by a gamma-secretase inhibitor attenuates AKT/ mammalian target of rapamycin signaling and glucose uptake in an ERBB2 transgenic breast cancer model[J].Cancer Res,2010,70(6)：2476-2484.

15 Zhu H,Bhaijee F,Ishaq N,et al.Correlation of Notch1,pAKT and nuclear NF-kappaB expression in triple negative breast cancer[J]. Am J Cancer Res,2013,3(2)：230-239.

16 Zhang CC,Pavlicek A,Zhang Q,et al.Biomarker and pharmacologic evaluation of the gamma-secretase inhibitor PF-03084014 in breast cancer models[J].Clin Cancer Res,2012,18(18)：5008-5019.

17 Zhang CC,Yan Z,Zong Q,et al.Synergistic effect of the gamma-secretase inhibitor PF-03084014 and docetaxel in breast cancer models[J].Stem Cells Transl Med,2013,2(3)：233-242.

18 Krop I,Demuth T,Guthrie T,et al.Phase I pharmacologic and pharmacodynamic study of the gamma secretase(Notch)inhibitor MK-0752 in adult patients with advanced solid tumors[J].J Clin Oncol,2012,30(19)：2307-2313.

19 Schott AF,Landis MD,Dontu G,et al.Preclinical and clinical studies of gamma secretase inhibitors with docetaxel on human breast tumors[J].Clin Cancer Res,2013,19(6)：1512-1524.

20 Speiser J,Foreman K,Drinka E,et al.Notch-1 and Notch-4 biomarker expression in triple-negative breast cancer[J].Int J Surg Pathol,2012,20(2)：139-145.

21 Azzam DJ,Zhao D,Sun J,et al.Triple negative breast cancer initiating cell subsets differ in functional and molecular characteristics and in gamma-secretase inhibitor drug responses[J].EMBO Mol Med,2013,5(10)：1502-1522.

22 Hoey T,Yen WC,Axelrod F,et al.DLL4 blockade inhibits tumor growth and reduces tumor-initiating cell frequency[J].Cell Stem Cell,2009,5(2)：168-177.

（2014-05-15收稿）

（2014-06-29修回）

Research progress in notch signaling pathway in breast cancer stem cells

Rong GUO,Jin ZHANG
Correspondence to:Jin ZHANG;E-mail:zhangjin@tjmuch.com

The Third Department of Breast Cancer,China Tianjin Breast Cancer Prevention,Treatment,and Research Center,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital;National Clinical Research Center of Cancer,Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therapy of Ministry of Education,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin 300060, China

This work was supported by the Municipal Key Special Project of Tianjin(No.12ZCDZSY15700)

Breast cancer stem cells(BCSC)are group of cells exhibiting self-renewal and multi-directional differentiation potentials.These cells have an important role in the occurrence,development,metastasis,and recurrence of breast cancer.In normal circumstances,the ability of mammary stem cells to differentiate and undergo self-renewal is governed by related signaling pathways. After this mechanism is destroyed,breast stem cells undergo abnormal differentiation,forming breast cancer stem cells that unlimitedly proliferate to develop into breast cancer.As research on BCSC increasingly deepens,regulation of BCSC by notch signaling and its crosstalk with several signaling pathways have drawn a great deal of attention in this field.This paper reports the signaling pathways of breast cancer stem cells and latest studies on this field to better understand the essential role of notch signaling pathway in the occurrence and development of breast cancer and corresponding clinical targeted therapy.

Notch,signaling pathway,breast cancer,breast cancer stem cells,targeting therapy

10.3969/j.issn.1000-8179.20140812

郭瑢 在读硕士研究生。研究方向为乳腺肿瘤外科。

天津医科大学肿瘤医院乳腺肿瘤三科，国家肿瘤临床医学研究中心，中国天津乳腺癌防治研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室，乳腺癌防治教育部重点实验室（天津市300060）

*本文课题受天津市科技项目（编号：12ZCDZSY15700）资助

张瑾 zhangjin@tjmuch.com

E-mail：ynkmgr@126.com