郑玉梅

（吉林省农安县中医院检验科，吉林 长春130200）

全血法流式细胞术检测血小板抗体的效果观察

郑玉梅

（吉林省农安县中医院检验科，吉林 长春130200）

目的探讨全血法流式细胞术检测血小板抗体的效果，初步建立并优化这种以全血为标本的流式细胞仪（FCM）检测血小板抗体的方法。方法应用FCM，以多种参数分析全血中的CD61标记的血小板群。结果采集检测所需的血样，其体积以微升为数量级单位，每次检测需要2 h，检测的阳性率与理论值呈明显正相关（r＞0.9，P＜0.001），含有CD61抗体的血小板占全部正常血小板的3%，可检测血小板计数低达10×109/L的标本。结论采用全血法流式细胞术，所需血样量少，较适合血小板极低或血小板抗体少的患者检测快速，本法比传统的定性检测法与定量检测法效果好，具有临床推广价值。

全血法；流式细胞术；检测；血小板抗体；效果观察

流式细胞仪是一种用于快速测定多量个体细胞特性的仪器，测定前对需要 析的细胞进行荧光标记，压缩氮让样品送入标本室，然后射入光敏感区，射入速率高达5000～10000个细胞/秒。这时，做好的荧光标记在一定波长的光下被激发，发射出荧光脉冲讯号，细胞的数量与信号的强度成正比。探测器收集仪器中的全血法流式细胞术和荧光讯号，最终传入计算机进行分析。传统方法应用流式细胞术检测血小板膜糖蛋白的表达，常用的样本是经洗涤的血小板及富含血小板的血浆。血小板易于被激惹活化，在样本离心、洗涤等过程中，极易激活体外血小板，影响临床诊断。因此，我院引进了全血法流式细胞术。现将全血法流式细胞术检测血小板抗体的效果观察综述如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取临床ITP患者38例，其中轻度15例、中度7例、重度16例。与其年龄段一致的正常对照20例。年龄为23～45岁，平均30.2岁。单克隆抗体（mAb）CD41（GPIIb）PE（Sigma，美国）；10 g/L多聚甲醛；FITC-抗人IgM、FITC-抗人IgG、FITC-抗人IgA、HRP-人IgG（Sigm a，美国）；流式细胞仪ACScan（ Becton-Dick inso，美国）[2]。

1.2 检查方法

①实验条件的确立：a.可重复性：首先考察同一实验操作者在相同实验条件下，同时对同一样本进行多次（=5）重复检测时检测结果的重现性；其次考察在相同实验条件下由不同操作人员同时对同一样本进行检测（次数=5）[3]。b.考察血液标本采集后体外放置时间对FCM检测血小板抗体的影响：分别在20 ℃下静置0、2、3、4、6、8、16、24 h后检测，其他操作步骤相同。c.单克隆抗体剂量的影响：在进行ELISA实验时，向同一样本中分别加入CD61单抗5、10、 20 L，进行平行实验。②FCM检测：在管中事先涂好肝素，制备得抗凝管。用1 mL针管抽取静脉血1 mL，注入灭菌后的抗凝管中，9∶1颠倒混匀。在显微镜下计数，调整细胞数为（20～60）×109/L。操作要迅速，调整细胞数后立即向Falcon管中加入5 μL CD41PE mAb 和50 μL血标本并混合均匀。调整恒温箱温度至20 ℃，遮光于暗处孵育20 min。孵育后立即加入2～8 ℃的多聚甲醛固定液，并混合均匀，保持温度在2～8 ℃放置30 min，等待进行FCM分析，分析要在24 h内完成。③ELISA检测：对分离出的血小板进行洗涤，在显微镜下计数，将血小板溶解，离心后弃去沉淀，取上清液进行ELISA检测。上清液100 μL，均匀加入96孔酶标板，加入4 mL/LHRP- IgG（酶联抗体），用移液枪吹打混匀，置于37 ℃下1 h。将96孔板取出，以洗涤液洗涤四遍后，向每孔加入底物100 μL，置于37 ℃下孵育10 min。取出后立即加入终止剂，在酶标仪洗涤分离出的血小板，计数后，溶解血小板，离心沉淀，取上清100 μL 加入酶标仪比色皿中。设置波长为492 nm，读取比色读数，计算含量。

1.3 统计学处理

观察两组结果，采用SPSS16.0统计软件进行分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

检测结果表明，血小板相关IgG及PAIgM的荧光强度随血小板减低程度的升高发生显著性升高（P＜0.05）。表明FCM法可用于检测血小板相关IgG及PAIgM，进而用于诊断ITG。用ELISA分别检测正常人、ITP患者血小板PA IgG，检出率分别为100%和39%，用FCM法，其检出率则分别为24%、56.52%，EL ISA与FCM 相比，阳性检测率明显不足。检测的阳性率与理论值呈明显正相关（r＞0.9，P＜0.001），含有CD61抗体的血小板占全部正常血小板的3%，可检测血小板计数低达10×109/L的标本。

3 讨 论

经过初步研究，我们发现全血法流式细胞术在样品的处理上比传统方法更为简单，ELISA法需要多种步骤，处理结果受人为因素影响较大。FCM能灵敏地从大量正常的血小板中检出3%含有CD61抗体的血小板，与其真实含量较为接近[4]。因此应用全血法流式细胞术检测血小板抗体，对患者的病情诊断具有较大的帮助，且结果的重复性好，数据客观真实。由于其样品的前处理步骤变少，对样品的干扰减小，样品更接近血浆中的真实生理状态。

[1] 钟明华,廖军鲜,龙红,等.流式细胞术检测红细胞相关抗体及临床应用[J].中日友好医院学报,2010,15(1):3-6.

[2] 李珉珉.流式细胞术检测血小板功能及其临床应用[J].中华医学检验杂志,2010,22(3):182-184.

[3] 徐成伟,卢鑫,陈颖洁,等.慢性特发性血小板减少性紫癜患者PAIgG、ACA IgG 的测定及意义[J].山东医药,2010,42(16):12-13.

[4] 余晖,高晓阳.全血法流式细胞术检测血小板相关抗体[J].细胞与分子免疫学杂志,2010,26(12):1296-1298.

R446.6

B

1671-8194（2014）21-0245-01