霍小蓓，张蕴莉，刘彦彦

辽宁医学院附属第一医院 检验科，辽宁锦州 121001

P-选择素基因多态性与冠心病的相关性

霍小蓓，张蕴莉，刘彦彦

辽宁医学院附属第一医院 检验科，辽宁锦州 121001

目的研究P-选择素基因多态性与冠心病(coronary heart disease，CHD)易感性之间的相关性。方法以2012年6月-2013年4月辽宁医学院附属第一医院心内科病房的200例冠心病患者为病例组，210例健康体检者为对照组，应用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)方法和DNA测序法，检测两组人群P-选择素基因启动子区-2123C/G、-1969G/A和-1817T/C的基因多态性，并将冠心病组分为心绞痛、心肌梗死和缺血性心力衰竭组，研究不同类型冠心病组与对照组之间P-选择素基因启动子区-2123C/G、-1969G/A和-1817T/C位点基因多态性分布的差异。结果P-选择素基因-2123C/G位点基因型和等位基因频率在冠心病组和对照组间的分布差异有统计学意义(χ2=6.124，P=0.047；χ2=7.355，P=0.008)，并且在心肌梗死组与对照组、缺血性心力衰竭组与对照组的分布差异也具有统计学意义(χ2=6.473，P=0.039；χ2=13.944，P=0.001)。-1817T/C和-1969G/A位点基因型和等位基因频率在冠心病组和对照组间以及不同类型冠心病组和对照组间的分布差异均无统计学意义(P＞0.05)。结论P-选择素基因-2123C/G位点多态性与冠心病易感性之间具有相关性。

P-选择素；冠心病；基因多态性；基因型；单倍型

冠心病的主要病因是冠状动脉粥样硬化，近年来，针对冠心病的发病机制提出了炎症细胞浸润、血小板聚集和血栓形成学说[1]。P-选择素属于凝集素家族的一种黏附分子，参与血小板与白细胞及血小板与内皮细胞之间的黏附和聚集，参与冠状动脉血栓的形成[2-3]。分子生物学研究表明，P-选择素存在多个位点的基因多态性，但这些位点的基因多态性与冠心病易感性之间的关系并未取得一致结论[4]。因此，为进一步研究P-选择素基因多态性与冠心病易感性之间的相关性，本研究采用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)方法和DNA测序法探讨P-选择素基因启动子区-2123C/G、-1969G/A和-1817T/C多态性与冠心病易感性之间的关系，为进一步揭示冠心病的发病机制提供理论依据。

对象和方法

1 研究对象 根据1979年WHO对冠心病的诊断标准，经冠状动脉造影、心脏彩超检查确诊的冠心病患者200例(心绞痛组90例、心肌梗死组79例和缺血性心力衰竭组31例)，男129例，女71例，年龄32 ～ 85(57.97±9.95)岁，均来自2012年6月-2013年4月辽宁医学院附属第一医院心内科病房。健康对照组210例选自体检健康人群的随机个体，男133例，女77例，年龄37 ～ 79(57.84±7.89)岁，血常规、血脂均在参考范围内，心电图检查正常，排除肝、肾、内分泌和心脑血管等疾病。研究对象为辽宁地区非血缘个体。

2 基因组DNA提取 取静脉血3 ml，EDTA-K2抗凝，采用人类全血基因DNA提取试剂盒(大连宝生物)提取白细胞基因组DNA，-70℃保存备用。

3 PCR扩增 参照Genbank公布的序列，引物由上海生工生物工程公司设计并合成。P-选择素的反应体系为25 μl，其中含10×PCR缓冲液2.5 μl，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μl，上、下游引物各20 pmol，模板DNA 2 μl，TaqDNA聚合酶1 U，不足体积用灭菌双蒸水补足至25 μl。置热循环仪(Thermo)中94℃预变性5 min；再按下列程序循环35次：94℃变性30 s，退火45 s，72℃延伸45 s，末次循环后，72℃延伸5 min。见表1。

4 扩增产物的限制性酶切 取PCR产物3 μl,用2 U相应的限制性内切酶酶切后，37℃孵育3 h，反应终止后，消化片段在8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，EB染色后通过凝胶成像系统判断结果，PCR产物进行基因测序。

5 统计学方法 用SPSS16.0软件进行分析。计量资料用±s表示，各组间数据的比较用非配对t检验。基因型和等位基因频率采用频率计数法计算，用Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验各基因型频率是否已达到遗传平衡，是否具有群体代表性[5]。各组间基因型及等位基因频率比较采用χ2检验，并以比值比(OR)及其95%置信区间(CI)表示相对风险度。以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 P-选择素基因扩增的引物序列和反应条件Tab. 1 Primer sequences and reaction conditions for ampli fi cation of P-selectin gene

表2 冠心病组和对照组的临床特征Tab. 2 Clinical characteristics of CHD group and control group

结 果

1 研究对象的临床特征 其中病例组和对照组的年龄、性别、体质量指数、高密度脂蛋白胆固醇水平差异无统计学意义(P＞0.05)，病例组血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇水平、吸烟者频数、高血压和糖尿病患者频数明显高于对照组(P＜0.05)。见表2。

2 P-选择素基因型分析及测序 P-选择素基因-2123C/G位点根据限制性内切酶BseRⅠ酶切产生片段长度的不同，基因型有3种，CC基因型(152 bp、95 bp 2条带)，GC基因型(247 bp、152 bp、95 bp 3条带)，GG基因型(247 bp 1条带)；-1969G/A位点根据限制性内切酶PstⅠ酶切产生片段长度的不同，基因型有3种，AA基因型(101 bp、69 bp 2条带)，GA基因型(170 bp、101 bp、69 bp 3条带)，GG基因型(170 bp 1条带)；-1817T/C位点根据限制性内切酶BsaB I酶切产生片段长度的不同，判定3种不同的基因型，TT基因型(141 bp、74 bp 2条带)，TC基因型(215 bp、141 bp、74 bp 3条带)，CC基因型(215 bp，1条带)(图1 ～图3)。P-选择素基因-2123C/G、-1969G/A和-1817T/C多态性PCR产物直接测序结果与Genbank参照序列相一致 (图 4 ～ 图 6)。

3 P-选择素基因型与冠心病的相关性分析 P-选择素基因型在两组人群中的分布频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡，具有群体代表性。经χ2检验及相关分析，P-选择素基因-2123C/G位点基因型在两组人群中的分布差异有统计学意义(χ2=6.124，P＜0.05)，等位基因频率在两组人群中的分布差异也有统计学意义(χ2=7.355，P＜0.05)；等位基因频率的相对风险分析发现，-2123C等位基因携带者患冠心病的风险是G等位基因的1.492倍(OR=1.492，95% CI：1.117 ～ 1.992，P＜ 0.05)。P-选择素基因-1817T/C和-1969G/A位点基因型和等位基因频率在两组人群中的分布差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

图 1 P-选择素基因-2123C/G多态性电泳结 1： GG基因型； 2： GC基因型； 3： CC基因型； M： 标准分子量图 2 P-选择素基因-1969G/A多态性电泳结果 1： GG基因型； 2： GA基因型； 3： AA基因型； M： 标准分子量图 3 P-选择素基因-1817T/C多态性电泳结果 1： TT基因型； 2： TC基因型； 3： CC基因型； M： 标准分子量Fig. 1 Electrophoresis showing P-selectin gene -2123G/C polymor-phism 1: Genotype GG; 2: Genotype GC; 3: Genotype CC; M: MarkerFig. 2 Electrophoresis showing P-selectin gene -1969G/A polymor-phism 1: Genotype GG; 2: Genotype GA; 3: Genotype AA; M: MarkerFig. 3 Electrophoresis showing P-selectin gene－1817T/C polymor-phism 1: Genotype TT; 2: Genotype TC; 3: Genotype CC; M: Marker

图 4 P-选择素基因-2123C/G测序图从左至右分别为GG、 GC和CC基因型(箭头所示为基因突变位点)Fig. 4 P-selectin gene -2123C/G sequencing map showing genotypes GG, GC and CC(Arrows indicate the gene mutation points)

图 5 P-选择素基因-1969G/A测序图从左至右分别为GG、 GA和AA基因型(箭头所示为基因突变位点)Fig. 5 P-selectin gene-1969G/A sequencing map showing genotypes GG, GC and CC(Arrows indicate the gene mutation points)

图 6 P-选择素基因-1817T/C测序图从左至右分别为TT、 TC和CC基因型(箭头所示为基因突变位点)Fig. 6 P-selectin gene-1969G/A sequencing map showing genotypes TT, TC and CC(Arrows indicate the gene mutation points)

4 P-选择素基因的单倍型分析 应用SHEsis分析软件对P-选择素基因-2123C/G、-1969G/A和-1817T/C这3个位点的单核苷酸多态性进行连锁不平衡分析，结果显示P-选择素基因-2123C/G、-1969G/A和-1817T/C单核苷酸多态性相互之间存在强烈的连锁不平衡(｜D'｜＞0.9)，在病例组和对照组主要的单倍型GGT所占比例分别为60.5%和64.5%。P-选择素基因-2123C/G、-1969G/A和－1817T/C位点单倍型在两组人群中分布差异无统计学意义(P＞0.05)。见表4。

5 P-选择素基因多态性与不同冠心病类型之间的关系 根据1979年WHO对冠心病的诊断标准，将冠心病患者分为心绞痛组、心肌梗死组和缺血性心力衰竭组。研究结果显示，心肌梗死组和缺血性心力衰竭组与对照组的P-选择素基因-2123C/G位点基因型和等位基因频率差异有统计学意义(χ2=6.437，P=0.039；χ2=13.944，P=0.001)，心绞痛组与对照组的差异无统计学意义(P＞0.05)。-1817T/C和-1969G/A位点基因型和等位基因频率在不同类型冠心病患者与对照组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 5。

表3 冠心病组与对照组P-选择素基因型和等位基因分布频率的比较Tab. 3 Frequency of P-selectin gene and allelic gene in CHD group and control group(n, %)

表5 不同类型冠心病组和对照组P-选择素基因型或等位基因频率分布Tab. 5 Frequency of P-selectin gene and allelic gene in different CHD groups and control group(n, %)

表4 冠心病组与对照组P-选择素基因单倍型分布频率的比较Tab. 4 Frequency of P-selectin Haplotype in CHD group and control group(n, %)

讨 论

冠心病是遗传因素和环境因素相互作用而导致的多因素疾病，寻找冠心病相关基因进而阐明冠心病的发病机制已经成为研究热点[6-7]。P-选择素是一种细胞黏附分子，表达在活化的血小板和内皮细胞表面，在炎症反应的启动、介导白细胞在内皮细胞的黏附和聚集以及血栓形成过程中起着非常重要的作用[8-9]。编码P-选择素基因是位于人类1号染色体(1q21 ～ 1q24)上一段50 kb的DNA，迄今为止，P-选择素基因已有10多种多态性被检测出来[10-11]。目前研究认为，P-选择素基因多态性可能导致人群对冠心病的易感性不同，也可导致冠心病患者的临床表现不同，甚至会影响CHD的治疗[10]。

近年来，P-选择素基因多态性与心血管疾病的研究有了初步发现，但在不同种族和不同地区之间P-选择素基因多态性与冠心病易感性之间的关系尚未取得一致结论[12]。Ghazouani等[13]在突尼斯人群中的研究发现P-选择素基因启动子区-2123C/G和-1969G/A位点基因多态性在冠心病组和对照组之间分布差异无统计学意义。Wei等[14]对于P-选择素基因单倍型的研究发现P-选择素基因启动子区-2123C/G、-1969G/A和-1817T/C位点单核苷酸多态性相互之间存在强烈的连锁不平衡，并且这3个位点单倍型在冠心病组和对照组之间分布差异无统计学意义。为进一步研究P-选择素基因多态性与不同类型冠心病之间的关系，夏尊恩等[15]在冠心病患者中对比了心绞痛组和心肌梗死组-2123C/G和-1817T/C位点基因多态性的分布，结果显示P-选择素-2123C/G位点基因多态性分布在两组间差异有统计学意义，而-1817T/C位点基因多态性分布在两组间的差异无统计学意义。

因此，本研究采用PCR-RFLP方法和DNA测序法来研究P-选择素基因多态性与冠心病易感性之间的联系。结果显示，P-选择素基因启动子区-2123C/G、-1969G/A和-1817T/C位点中，-2123C/G位点基因型和等位基因频率与冠心病易感性之间可能具有相关性。单倍型分析结果显示P-选择素基因-2123C/G、-1969G/A和-1817T/C单核苷酸多态性相互之间存在强烈的连锁不平衡，并且这3个位点单倍型在两组人群中分布差异无统计学意义。对于不同类型冠心病与P-选择素基因多态性的关系，文献报道较少，本研究将病例组分为心绞痛组、心肌梗死组和缺血性心力衰竭组来进一步探讨两者之间的关系，研究结果显示心肌梗死组和缺血性心力衰竭组与对照组的P-选择素基因-2123C/G位点基因型和等位基因频率差异有统计学意义，提示-2123C/G位点基因多态性可能与冠心病的严重程度存在联系。-1969G/A和-1817T/C位点基因型和等位基因频率在病例组和对照组之间以及不同类型冠心病组和对照组之间的分布差异均无统计学意义，提示-1969G/A和-1817T/C位点基因多态性与冠心病易感性之间无显著联系。

综上所述，本研究发现P-选择素基因-2123C/G位点多态性可能与冠心病以及冠心病的严重程度具有一定的相关性，而-1817T/C和-1969G/A位点多态性与冠心病易感性之间无明显联系。此研究样本量有限，有很多限制条件，并且在不同种族之间P-选择素基因多态性分布也存在差异，因此需要在大样本量和不同种族的研究进一步确认P-选择素基因多态性与冠心病之间的联系，为预防和早期发现冠心病提供理论依据[16]。

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Correlation between P-selectin gene polymorphism and coronary heart disease

HUO Xiao-bei, ZHANG Yun-li, LIU Yan-yan
Department of Laboratory Medicine, First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College, Jinzhou 121001, Liaoning Province,China

ZHANG Yun-li. Email: zyl8546@126.com

ObjectiveTo study the correlation between P-selectin gene polymorphism and coronary heart disease(CHD).MethodsTwo hundred CHD patients admitted to our hospital from June 2012 to April 2013 served as a CHD group and 210 subjects undergoing physical examination served as a control group in this study. Polymorphism of their P-selectin genes -2123C/G,-1969G/A and-1817T/C was detected by PCR-RELP and DNA sequencing, respectively. CHD patients were further divided into angina pectoris group, myocardial infarction group and ischemic heart failure group. Difference in polymorphism of P-selectin genes -2123C/G,-1969G/A and -1817T/C was observed in different types of CHD.ResultsThe frequency of P-selectin gene -2123C/G and allelic gene was significantly higher in CHD group than in control group(χ2=6.124, P=0.047; χ2=7.355, P=0.008) and in myocardial infarction group and ischemic heart failure group than in control group(χ2=6.473, P=0.039; χ2=13.944, P=0.001). However, no significant difference was found in the frequency of P-selectin genes -1817T/C and -1969G/A and allelic gene between CHD group and control group(P＞0.05).ConclusionP-selectin gene -2123C/G polymorphism is correlated with CHD．

P-selectin; coronary disease; gene polymorphism; genotype; haplotype

R 541.4

A

2095-5227(2014)04-0374-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.04.021

时间：2013-11-25 11:45 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20131125.1145.004.html

2013-10-11

霍小蓓，女，在读硕士。研究方向：基因的诊断和治疗。Email: abcde1599@126.com

张蕴莉，女，博士，硕士生导师。Email: zyl8546@126.com