闫 雷，毕世欣，赵启慧，王 喆，潘东琪，曲娟娟

（东北农业大学 资源与环境学院 寒地黑土资源利用与保护重点实验室，黑龙江 哈尔滨150030）

抗生素（antibiotics）是20世纪最伟大的发明之一，其发明后被用于预防和治疗人类及动物的疾病，同时作为促生长剂长期添加于动物饲料中加快畜禽及水产品的生长。土霉素（OTC）是四环素类抗生素之一，具有质优价廉、广谱抗菌性的特点，在畜禽生产中应用广泛。进入动物机体内的大部分土霉素不能完全被吸收，高达75%以上以原形或代谢物形式经由畜禽粪尿排入环境，经不同途径（堆肥）对土壤和水体造成污染［1－4］。Hamscher等 人［5］研 究 了 兽 用 抗 生素在土壤中的残留，发现四环素在土壤10—20cm处可达200μg／kg。德国施用动物粪肥后的土壤中土霉素的残留最大浓度为32.3mg／kg［6］。在我国，大型养殖场周围土壤中土霉素含量高达200mg／kg［7］，在水产养殖厂的沉积物中更是高达285mg／kg［8］。重金属污染已成为人们日益关注的问题，中国环境保护部和国土资源部于2014年4月17日发布的“全国土壤污染状况调查公报”中指出，全国土壤重金属污染总的点位超标率为16.1%。与其他重金属相比，镉（Cd）在土水系统中有较高的迁移能力，更易对环境产生毒害［9］。调查发现我国珠三角地区土壤中Cd含量在0.57～11.0mg／kg［10］，湖南宝山矿区局部表层土壤Cd含量高达2 587mg／kg［11］。江苏省某市疾病预防控制中心在对该市从事饲料生产的企业调查时发现，某些猪饲料中镉的含量高达370mg／kg［12］。这主要是由于锌矿中常含有镉，当锌矿作为矿物质原料被添加到饲料中时可能会造成镉的污染；另外，使用镀镉机具加工饲料，也可能是造成镉污染的原因之一［13－14］。摄入过量的镉对生物体的危害极其严重，会导致肾脏、肝脏、肺部、骨骼、生殖器官的损伤，对免疫系统、心血管系统等具有毒性效应，进而引发多种疾病。

抗生素与重金属复合污染物通常通过畜禽粪便进入土壤生态系统中，其复合污染对环境的影响日益突出，成为热点关注问题，目前国内外研究者［15－20］针对抗生素和重金属污染已有大量研究。张树清等［15］对我国7省、市、自治区的典型规模化养殖场畜禽粪便的主要成分分析发现，猪粪中土霉素平均含量为9.09mg／kg，最高达134.75mg／kg，重金属镉的平均含量为13.25mg／kg，最高达120.13mg／kg。De等［16］研究发现南极地区的水域中存在具有重金属和抗生素抗性的菌落。吴丹等人［17］研究发现过氧化氢酶和蔗糖酶活性在Cd浓度为10mg／kg的时候达到最高值。刘琳等［19］研究表明OTC对土壤中蔗糖酶、脲酶和磷酸酶活性毒性强度随着投加浓度升高而增加。Kong等人［20］研究OTC与Cu复合污染对水稻土土壤微生物群落功能时发现，OTC和Cu对土壤微生物群落功能多样性、均一度和平均颜色变化率（AWCD）的负面影响有明显的加合作用。但有关抗生素和重金属复合污染对东北地区典型耕作土壤—黑土土壤生态系统的影响研究还鲜见报道。本研究以土霉素和重金属镉作为目标污染物，采用室内培养法，通过探讨微生物呼吸和土壤酶活性的变化规律，以期进一步完善抗生素与重金属的生态毒理效应研究，为其环境风险评价提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试土壤采自东北农业大学试验田（土霉素和重金属镉未见检出）。除去地面植被、枯枝落叶及表面1cm左右的表土，采样深度为2～20cm，过20目筛，风干后装袋备用。其理化性质详见表1。土霉素原药（纯度≥88.8%），购自黑龙江省药检所，其他试剂均为分析纯。

表1 供试土壤理化性质

1.2 试验设计

1.2.1 土壤呼吸强度测定 取部分冷藏于冰箱中的风干土样，在25℃的培养箱中预培养7d，以恢复微生物活性。称取若干份土壤，每份50g置于100ml的高型烧杯中，加入1.0g葡萄糖，混匀，加入不同质量分数的土霉素溶液或硫酸镉溶液。试验分为两个处理组，第一组：单一处理组，使土霉素在土壤中的浓度分别为0，1，50和200mg／kg，重金属镉在土壤中的浓度为10mg／kg；第二组：复合处理组，使土霉素和重金属镉在土壤中的浓度分别为：〔（OTC＋Cd）＝（1＋10）mg／kg〕，〔（OTC＋Cd）＝（50＋10）mg／kg〕，〔（OTC＋Cd）＝（200＋10）mg／kg〕。各处理均设3个重复，并调节土壤含水量达田间最大持水量的60%，置于密闭容器中。同时将盛放有35ml 0.1mol／L NaOH的100ml的高型烧杯放入密闭容器底部，盖严瓶盖，分别于培养后的1，7，15，21，27d测定其呼吸强度。土壤呼吸强度采用直接吸收法滴定测定［21］。

1.2.2 土壤酶活性测定 取部分冷藏于冰箱中的风干土样，在25℃的培养箱中预培养7d，以恢复微生物活性。称取若干份土壤，每份100g置于三角瓶中，加入不同质量分数的土霉素溶液或硫酸镉溶液。试验分为两个处理组，第一组：单一处理组，使土霉素在土壤中的浓度分别为0，1，50和200mg／kg，重金属镉在土壤中的浓度为10mg／kg；第二组：复合处理组，使土霉素和重金属镉在土壤中的浓度分别为：〔（OTC＋Cd）＝（1＋10）mg／kg〕，〔（OTC＋Cd）＝（50＋10）mg／kg〕，〔（OTC＋Cd）＝（200＋10）mg／kg〕。各处理均设3个重复，定期加水以保持土壤含水量为田间最大持水量的60%。分别于第1，7，15，21，27天取样测定蔗糖酶、脲酶和磷酸酶的酶活性。土壤酶活性测定参见关松荫等方法［22］，土壤蔗糖酶采用3，5—二硝基水杨酸比色法；土壤脲酶采用苯酚钠—次氯酸钠比色法；土壤磷酸酶采用磷酸苯二钠比色法。

1.3 数据处理

土壤呼吸和土壤酶活性的影响率计算公式为：

式中：A——添加污染物土壤呼吸或土壤酶活性；B——不添加污染物土壤呼吸或土壤酶活性，正值表示激活，负值表示抑制。复合污染的交互作用类型的判断参考沈国清与Gao等方法［23－24］，当复合处理的实测值＞理论值时，表示协同作用；当实测值＜理论值时，表示拮抗作用。其中，理论值为各处理浓度下平均影响率的加和；实测值为试验实际测定影响率。试验数据采用Excel处理，统计分析采用SPSS软件。

2 结果与分析

2.1 土霉素与镉对土壤微生物呼吸的影响

在室内模拟条件下，镉单一污染对土壤微生物呼吸的影响结果如图1所示。从图1可以看出，10mg／kg Cd处理下，培养第1天即对土壤微生物呼吸产生了强烈的抑制作用，抑制率高达78.05%。这可能是由于在培养初期重金属产生的毒性抑制甚至杀死了部分敏感的土壤微生物，导致土壤微生物呼吸下降［25］。当培养第7天时，发现Cd对土壤微生物呼吸的影响转为激活作用，但激活率不高，只有6.66%。随着培养时间的延长，激活作用逐渐增强，第21天达最大激活率38.75%；而后激活率逐渐降低，直至培养结束恢复到对照水平（p＞0.05）。分析其原因可能是在重金属的胁迫下，微生物代谢过程的能源利用效率降低，需要更多的碳进行维护并最终增加呼吸；另一方面杀死微生物时发生的分解反应也会增加基底呼吸，进而达到激活的效果［26］。而到培养后期，土壤微生物逐步适应了这种环境，恢复到对照水平。

图1 镉单一污染对土壤微生物呼吸的影响

土霉素单一污染对土壤微生物呼吸的影响结果如图2所示。从图2可以看出，在整个培养过程中（1～27d），1mg／kg OTC浓度处理对土壤微生物呼吸具有明显的激活作用（p＜0.05），50和200mg／kg OTC对土壤微生物呼吸的影响表现为先抑制后激活，且OTC浓度越高，对微生物呼吸抑制作用时间越长。已有的研究报道发现，虽然OTC可抑制土壤中细菌和放线菌的生长，但可以促进真菌的生长［27－28］。本试验中1mg／kg OTC对土壤微生物的呼吸激活效应可能是由于土壤中细菌和放线菌活性受到抑制，真菌等其他微生物获得大量营养物质，从而活性增强；另外，抗生素本身作为碳源被微生物分解利用，或其通过物理或化学作用的降解释放出二氧化碳，增加了呼吸量［29］。而当OTC污染浓度不断增大，施药后土壤中抗生素含量超过了影响土壤微生物呼吸作用的浓度阈值，甚至杀死了某些微生物，因此表现为抑制［30］。但这种抑制作用是非持续性的，当抗生素的含量低于药物对土壤微生物呼吸影响的浓度阈值时，呼吸作用逐渐开始恢复。另一方面随着土壤微生物耐受性增加，土壤中产生抗性种群，以该种抗生素为碳源，促使土壤微生物的呼吸由抑制逐渐恢复正常直至转为激活［31］。

图2 土霉素单一污染对土壤微生物呼吸的影响

土霉素与镉复合污染对土壤微生物呼吸的影响结果如图3所示。从图3可以看出，与单一污染处理相比，在1mg／kg OTC与10mg／kg Cd复合处理下对土壤微生物呼吸的影响呈现出“抑制—激活—抑制”的规律。且在7～21d复合处理的影响与两者单一处理时趋势一致，均为显著的激活作用（p＜0.05），在此阶段OTC，Cd两者单一处理的平均激活率分别为46.04%和20.87%，复合处理平均激活率为132.86%，为两者单一处理之和的2倍左右，Cd增强了对土壤微生物呼吸的激活作用。表2为OTC与Cd对土壤微生物呼吸和土壤酶活性的平均影响率及其交互作用类型。从表2中可以看出，复合处理〔（OTC＋Cd）＝（1＋10）mg／kg〕对土壤微生物呼吸影响的实测值＞理论值，总体来看，交互作用类型为协同激活。当OTC的处理浓度逐渐增大，达到〔（OTC＋Cd）＝（50＋10）mg／kg〕时，培养第1天为激活作用，这与两者单一污染时的抑制作用相反，表明复合污染使土壤CO2的释放量增加了，土壤微生物呼吸由原来的受抑制转为被激活。从培养第7天开始，复合污染对微生物呼吸的影响与OTC单一作用时趋势一致，第15天时出现了最高激活率300.82%，总体来说复合处理表现出协同激活作用。当OTC的污染浓度进一步增大至〔（OTC＋Cd）＝（200＋10）mg／kg〕时，复合处理对土壤微生物呼吸作用的影响与OTC单一污染时完全一致，均为先抑制后激活，交互作用类型为拮抗激活。

图3 土霉素与镉复合污染对土壤微生物呼吸的影响

表2 土霉素与镉对土壤微生物呼吸和土壤酶活性的交互影响率

2.2 土霉素与镉对蔗糖酶活性的影响

蔗糖酶又称转化酶，广泛存在于土壤中，对于增加土壤中易溶解的营养物质起重要作用。一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶的活性越强［32］。镉单一污染对蔗糖酶活性的影响如图4所示。从图4可以看出，在整个培养过程中（1～27d）重金属镉对蔗糖酶的影响为显著抑制作用（p＜0.05），抑制率随时间延长先增大后减小，最大抑制率为20.92%（第7天）。郝英华等人［33］的研究也发现，Cd可以抑制土壤蔗糖酶的活性。抑制作用可能是由于添加重金属后抑制了土壤微生物的生长和繁殖，减少了体内酶的合成量和分泌量，削弱了土壤中C，N营养元素的循环速率和能量流动，最终导致土壤酶活性下降［34］。

图4 镉单一污染对土壤蔗糖酶活性的影响

土霉素单一污染对蔗糖酶活性的影响如图5所示。从图5可以看出，土霉素单一污染下，培养第1和第7天，所有处理浓度的OTC均对蔗糖酶表现为显著抑制（p＜0.05），抑制率随浓度的升高而增大，最大抑制率为77.24%（200mg／kg，第7天）。培养第15和第21天，除1mg／kg处理转为激活作用外，其余各处理仍为显著抑制（p＜0.05）。培养第27天，200mg／kg处理也转为激活作用，只有50mg／kg处理仍为抑制作用。总体来说，在整个培养过程中（1～27d），1mg／kg OTC对蔗糖酶活性的影响呈现先抑制后激活的规律，其余各浓度处理主要表现为抑制作用。这也进一步验证了Gao等人［24］的试验，他们在研究100mg／kg OTC对蔗糖酶活性的影响时发现，OTC对蔗糖酶的影响均为显著的抑制作用（p＜0.05）。由于土壤与OTC电荷形式差异，及OTC含有较多极性／离子型官能团可引发阳离子交换、金属离子架桥和氢键作用等原因，在酸性和中性条件下土壤易于对OTC进行吸附，并且在酸性环境中OTC较为稳定，半衰期较长［35］。本试验中土壤的pH值为6.5，因此较高浓度OTC胁迫对系统内微生物存在长期毒性作用，从而造成土壤酶活性显著降低。

图5 土霉素单一污染对土壤蔗糖酶活性的影响

土霉素与镉复合污染对蔗糖酶的影响结果如图6所示。由图6可知，复合污染下蔗糖酶活性显著降低（p＜0.05），且复合处理中OTC浓度越大，蔗糖酶活性越小，说明复合污染对蔗糖酶活性存在显著的抑制作用。同时可以看出，随着培养时间的延长，各处理浓度下的复合污染对蔗糖酶活性的抑制作用基本上逐渐减弱。与OTC和Cd单独处理时相比，除〔（OTC＋Cd）＝（1＋10）mg／kg〕外，其余各复合处理对蔗糖酶的影响情况与单一污染时相同，复合污染交互作用类型均为拮抗抑制。该结果与已有的相关文献报道较为相似，如沈国清等人［23］研究发现，菲和镉复合污染在整个培养期间（1～49d）始终抑制了蔗糖酶的活性，平均抑制率达53.57%，复合污染表现为协同抑制作用。

图6 土霉素与镉复合污染对土壤蔗糖酶活性的影响

2.3 土霉素与镉对脲酶活性的影响

脲酶是一种酞胺水解酶，在土壤中主要来自于植物和微生物，其在氮肥利用和土壤氮素代谢方面有重要意义［32］。镉单一污染对脲酶活性的影响结果如图7所示。由图7可见，重金属Cd对脲酶具有显著抑制作用（p＜0.05），这与程金金和张平等人［36－37］的研究结果一致。其抑制机理可能与酶分子中的活性部位巯基和含咪唑的配体等结合，形成较稳定的络合物，产生了与底物的竞争性抑制作用有关［38］。

图7 镉单一污染对土壤脲酶活性的影响

土霉素单一污染对脲酶活性的影响结果如图8所示。由图8可知，1mg／kg OTC在整个培养期对脲酶活性具有抑制作用。在培养第1天和第27天的抑制率不超过1%，与对照相比无显著差异（p＞0.05），培养中期（7～21d）抑制率为3.89%～13.45%。当OTC处理浓度增至50mg／kg时，对脲酶活性的影响呈现出“激活—抑制—激活”规律，试验结果与文献报道不十分一致，Yang等人［39］研究认为50mg／kg OTC对小麦根际土壤脲酶活性无明显的影响。这可能是因为根际土壤微生物活性较高，对外来物质的胁迫具有更强的抗性。本试验中出现激活作用可能是由于OTC具有酰胺键结构，而脲酶以酰胺键作为底物，根据底物诱导原理，导致OTC对脲酶活性的正效应大于负效应，即为激活［40］。当OTC单独处理浓度达到200mg／kg，其对脲酶活性表现出显著的抑制作用（p＜0.05）。刘惠君等［41］在研究酰胺类除草剂与脲酶的相互作用机制时发现，除草剂与脲酶之间有结合作用，二者之间可形成结合位点，并且溶解度越大，结合作用越强。高浓度OTC（200mg／kg）与脲酶分子之间可能也存在着这种作用机制，形成结合位点而发生作用，从而抑制了脲酶活性。

图8 土霉素单一污染对土壤脲酶活性的影响

土霉素与镉复合处理对土壤脲酶的影响结果如图9所示。从图9可以看出，〔（OTC＋Cd）＝（1＋10）mg／kg〕复合处理条件下，培养第1天显著抑制了脲酶活性，抑制率高达26.05%，与两者单一污染时相比，脲酶活性明显降低，这表明在培养第1天复合处理在一定程度上增强了对脲酶的抑制作用。从培养第7天开始，〔（OTC＋Cd）＝（1＋10）mg／kg〕复合处理对脲酶转为激活作用，但激活率不高，始终没有超过5%，总体来看复合处理仍为拮抗抑制。当复合处理浓度为〔（OTC＋Cd）＝（50＋10）mg／kg〕和〔（OTC＋Cd）＝（200＋10）mg／kg〕时，对脲酶的影响均为抑制作用，抑制率随时间的延长呈现“下降—上升—下降”的规律，最大抑制率为65.14%〔第15d，（200＋10）mg／kg〕。统计分析结果发现，在整个培养过程中（1～27d），除第7天处理浓度为〔（OTC＋Cd）＝（1＋10）mg／kg〕和〔（OTC＋Cd）＝（200＋10）mg／kg〕外，其余各浓度处理下，两者单独污染与复合污染对脲酶相比都有显著差异（p＜0.05）。

图9 土霉素与镉复合污染对土壤脲酶活性的影响

2.4 土霉素与镉对磷酸酶活性的影响

磷酸酶是一类催化土壤有机磷化合物矿化的酶，其活性高低直接影响着土壤中有机磷的分解、转化及其生物有效性［32］。镉对磷酸酶活性的影响结果如图10所示。从图10可以看出，重金属镉单独处理对磷酸酶活性具有抑制作用，最大抑制率为30.04%，但抑制率随培养时间的变化呈现一定波动性，表现为“增大—减小—增大”的现象。这与陆文龙［42］的研究结果一致，该研究在分析10mg／kg Cd污染对土壤磷酸酶活性的影响时也发现，随着培养时间的延长，其抑制率也表现出“增大—减小—增大”的波动性。同样，Khan和 Moreno［43－44］的研究也表明 Cd能抑制土壤磷酸酶的活性。

图10 镉单一污染对土壤磷酸酶活性的影响

土霉素单一污染对磷酸酶活性的影响结果如图11所示。从图11可以看出，培养第1天，1mg／kg OTC浓度处理对磷酸酶活性的影响为抑制，但抑制率很低，仅为4.48%，与对照相比无显著差异（p＞0.05）；50和200mg／kg处理表现为显著激活（p＜0.05），最大激活率为88.56%（50mg／kg OTC）。培养第7天，除200mg／kg处理仍为显著的激活作用（p＜0.05），OTC其余浓度处理对磷酸酶均转为显著性抑制（p＜0.05），抑制率在7.33%～26.01%。随着时间的推移，至第27天，OTC各浓度处理对磷酸酶的抑制或激活已降至较低水平，说明此时磷酸酶受OTC的影响已基本恢复。本试验中，200mg／kg OTC在整个培养期内，对磷酸酶活性的影响以激活作用为主，这也进一步证实了Gao等人［24］的研究，较高浓度处理OTC对碱性磷酸酶的活性具有激活作用。

土霉素与镉复合处理对磷酸酶的影响结果如图12所示。从图12可以看出，复合处理为〔（OTC＋Cd）＝（1＋10）mg／kg〕时，在整个培养过程中（1～27 d），对磷酸酶的影响呈现出“抑制—激活—抑制”的规律，复合处理表现为拮抗抑制作用。统计分析结果表明，除第1天外，其余培养时间内土霉素—镉复合处理对磷酸酶的影响与OTC单独处理具有显著差异（p＜0.05）。土霉素—镉复合污染为〔（OTC＋Cd）＝（50＋10）mg／kg〕时，对磷酸酶的影响呈现“激活—抑制—激活—抑制”的规律，主要表现为拮抗激活作用。〔（OTC＋Cd）＝（200＋10）mg／kg〕在整个培养过程中呈现先激活后抑制的规律，最大激活率为18.89%，复合处理表现为协同激活作用。总体来说，复合污染的作用效果与OTC单一污染时基本相同，均呈现一定的波动性，其作用机理有待进一步研究。

图11 土霉素单一污染对土壤磷酸酶活性的影响

图12 土霉素与镉复合污染对土壤磷酸酶活性的影响

3 结论

（1）重金属镉单独污染时，对土壤微生物呼吸表现出先抑制后激活作用；对土壤酶活性具有显著抑制作用，平均抑制率从大到小依次为：蔗糖酶＞磷酸酶＞脲酶。

（2）土霉素单独污染时，1mg／kg土霉素可显著激活土壤微生物呼吸，而50或200mg／kg土霉素对土壤微生物呼吸表现为先抑制后激活；各处理浓度下的土霉素对蔗糖酶和脲酶活性具有抑制作用，对磷酸酶活性的影响呈现出一定的波动性。

（3）土霉素与镉复合污染对土壤微生物呼吸和土壤酶活性的交互作用的影响较为复杂，交互作用类型与土霉素浓度有一定的关联性，主要表现为，当土霉素的浓度为1和200mg／kg时，复合污染主要为拮抗作用，但当土霉素的浓度为50mg／kg时，复合污染主要为协同作用。

（4）与土壤酶活性相比，土壤微生物呼吸对土霉素与镉胁迫条件下的反应更为敏感。

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