王媛媛 曹 建 邓 莉 陈 勤 欧阳先国.南昌市第三医院心内科，南昌 330009；2.南昌大学第二附属医院麻醉科，南昌 330006

依达拉奉联合乌司他丁对大鼠缺血/再灌注心肌细胞凋亡的影响

王媛媛1曹 建2▲邓 莉1陈 勤1欧阳先国1
1.南昌市第三医院心内科，南昌 330009；2.南昌大学第二附属医院麻醉科，南昌 330006

目的 研究依达拉奉联合乌司他丁对大鼠缺血/再灌注心肌细胞凋亡的影响。 方法 将50只实验动物随机分为假手术组、缺血/再灌注组、缺血/再灌注+依达拉奉组、缺血/再灌注+乌司他丁组、缺血/再灌注+依达拉奉+乌司他丁组，采用垫扎球囊法结扎冠状动脉制作大鼠心肌缺血/再灌注模型。测定心肌组织谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）的含量，采用TUNEL法进行细胞凋亡检测，用Western-blot方法测定凋亡因子Caspase-3、Caspase-9的表达。 结果 与假手术组比较，缺血/再灌注组的GSH明显减少 （P<0.01），MDA及心肌凋亡指数明显升高（P<0.05），Caspase-3、Caspase-9蛋白表达增加（P<0.01）；与缺血/再灌注组比较，各药物组的 GSH 活性显著增加（P<0.05），MDA 含量及心肌凋亡指数明显减少（P<0.05），Caspase-3、Caspase-9 蛋白表达降低（P<0.05），联合药物治疗组优于单独药物治疗组（P<0.01）。 结论 依达拉奉联合乌司他丁具有抗心肌缺血/再灌注损伤作用，其机制可能是通过调节Caspase-3和Caspase-9介导的细胞凋亡而实现。

心肌缺血/再灌注损伤；细胞凋亡；依达拉奉；乌司他丁

心肌缺血/再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI）指短时间心肌血供中断，一定时间内恢复血供，原缺血心肌发生较血供恢复前更严重的损伤。研究表明氧自由基、钙超载、心肌纤维能量代谢障碍、血管内皮细胞、细胞凋亡等因素均可能参与MIRI的发病过程[1-3]。本研究在冠状动脉再灌注前给予注射依达拉奉、乌司他丁、依达拉奉联合乌司他丁进行药物后处理，与缺血后处理对照，观察其对大鼠MIRI的作用效果，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料

取10周左右雄性SD大鼠50只，体重（200±20）g，由南昌大学动物实验中心提供。依达拉奉注射液（南京先声药业有限公司生产，国药准字20031342）10 mg/支，乌司他丁（广东天普生化医药股份有限公司生产，批号 03080806）100 000 U/瓶，谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）检测试剂盒购自武汉亚法生物制品有限公司，Caspase-3、Caspase-9多克隆抗体购自美国Bioworld生物技术公司，碱性磷酸酶（AP）显色底物，anti-NF-κB，小鼠单抗辣根酶标记兔抗山羊IgG；anti-β-actin山羊单抗（SantaCruz产品）。

1.2 模型制作及分组

将实验动物50只随机分为5组，假手术组（n=10），丝线穿过冠状动脉左室支但不结扎，经尾静脉注射生理盐水。其余4组参考赵秀梅等[4]的垫扎球囊法制作大鼠体心肌缺血/再灌注模型。将充盈的球囊（215 mm×10 mm）垫于冠状动脉前降支与结扎线之间，用力结扎，观察结扎区域变白，局部心肌运动减弱，两个以上导联上出现ST段明显上抬，提示结扎成功，45 min后将球囊快速抽空便可即刻实现前降支血流再灌注（以心电图相关导联ST段明显回落为标准），并持续再灌注3 h。缺血/再灌注组（n=10），结扎冠状动脉后5 min分别通过尾静脉接受静脉注射生理盐水，45 min后放松扎线使冠状动脉再通形成再灌注3 h至实验结束；缺血/再灌注+依达拉奉组（n=10），结扎冠状动脉后5 min通过尾静脉接受静脉注射依达拉奉1.5 ml/（kg·h），其余同缺血/再灌注组；缺血/再灌注+乌司他丁组（n=10），结扎左冠状动脉左室支前30 min静脉注射乌司他丁（50 000 U/kg），其余同缺血/再灌注组；缺血/再灌注+依达拉奉+乌司他丁组（n=10），结扎左冠状动脉左室支前30 min静脉注射乌司他丁（50 000 U/kg），结扎冠状动脉后5 min通过尾静脉接受静脉注射依达拉奉 1.5 ml/（kg·h），其余同缺血/再灌注组。 实验结束后取大鼠左心室游离壁心肌组织迅速置液氮中冷却并于-80℃冻存。

1.3 GSH、MDA含量测定

实验结束后即刻分别取缺血区及正常供血区左心室心肌组织1.0 g，低温状态下生理盐水冲洗干净，制成心肌匀浆液，离心后取上清液，按GSH、MDA试剂盒说明书操作，检测GSH、MDA的含量。

1.4 细胞凋亡的检测（TUNEL法）

心脏标本用中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，制片，切片按试剂盒进行细胞凋亡检测。凋亡指数为计数1000个心肌细胞中染色阳性的凋亡细胞。

1.5 Western-blot法检测Caspase-3、Caspase-9蛋白水平

分别取5组心肌组织，提取总蛋白，收集上清液，考马斯亮蓝法进行蛋白定量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离样品后电泳转移至硝酸纤维膜上，TBST常温下封闭过夜后，分别加入anti-NF-κB小鼠单抗（一抗）、室温下免疫沉淀1 h，加入辣根酶标记兔抗山羊IgG（二抗）2 h。洗膜，显色。用Gel-Pro-Analyzer分析软件分析通道蛋白的灰度值。

1.6 统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件对实验数据进行分析，计量资料用±s表示，多组间比较应用单因素方差分析，组间两两比较应用q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各实验组GSH、MDA水平的比较

与假手术组比较，缺血/再灌注组的GSH含量明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；与缺血/再灌注组比较，缺血/再灌注+依达拉奉组、缺血/再灌注+乌司他丁组的GSH含量显著增加（P<0.05），缺血/再灌注+依达拉奉+乌司他丁组的GSH含量优于缺血/再灌注+依达拉奉组、缺血/再灌注+乌司他丁组，差异有统计学意义（P<0.01）。与假手术组比较，缺血/再灌注组的MDA含量明显增加（P<0.01）；与缺血/再灌注组比较，缺血/再灌注+依达拉奉组、缺血/再灌注+乌司他丁组的 MDA含量显著减少（P<0.05），缺血/再灌注+依达拉奉+乌司他丁组的MDA含量优于缺血/再灌注+依达拉奉组、缺血/再灌注+乌司他丁组，差异有统计学意义（P<0.01）（表 1）。

表1 各实验组GSH、MDA水平的比较（±s，n=10）

表1 各实验组GSH、MDA水平的比较（±s，n=10）

与假手术组比较，*P<0.01；与缺血/再灌注组比较，#P<0.05；与缺血/再灌注+依达拉奉组、缺血/再灌注+乌司他丁组比较，△P<0.01

组别 GSH（mg/L） MDA（nmol/L）假手术组缺血/再灌注组缺血/再灌注+依达拉奉组缺血/再灌注+乌司他丁组缺血/再灌注+依达拉奉+乌司他丁组241.42±3.28 180.26±2.14*200.14±3.16#197.27±4.38#221.57±3.52△4.13±3.27 10.13±2.13*8.42±5.16#8.15±4.26#7.24±1.18△

2.2 缺血/再灌注心肌凋亡细胞TUNEL法染色结果

凋亡的细胞核呈现为黄色、棕黄色或棕褐色，主要是心肌细胞，少数为浸润的淋巴细胞和血管内皮细胞。假手术组仅见极少数散在的凋亡细胞；缺血/再灌注组凋亡细胞明显增加，凋亡细胞多位于心肌梗死区与非梗死区交界处，它主要来自于心肌细胞；缺血/再灌注+依达拉奉组、缺血/再灌注+乌司他丁组及缺血/再灌注+依达拉奉+乌司他丁组与缺血/再灌注组比较，凋亡细胞明显减少。与假手术组比较，缺血/再灌注组心肌凋亡指数明显增加（P<0.01）；与缺血/再灌注组比较，缺血/再灌注+依达拉奉组、缺血/再灌注+乌司他丁组心肌凋亡指数明显降低（P<0.05），缺血再灌注+依达拉奉+乌司他丁组优于缺血/再灌注+依达拉奉组、缺血/再灌注+乌司他丁组（P<0.01）（表 2）。

表2 各实验组心肌细胞凋亡指数的比较（±s，n=10）

表2 各实验组心肌细胞凋亡指数的比较（±s，n=10）

与假手术组比较，*P<0.01；与缺血/再灌注组比较，#P<0.05；与缺血/再灌注+依达拉奉组、缺血/再灌注+乌司他丁组比较，△P<0.01

组别 心肌细胞凋亡指数假手术组缺血/再灌注组缺血/再灌注+依达拉奉组缺血/再灌注+乌司他丁组缺血/再灌注+依达拉奉+乌司他丁组4.62±1.24 12.24±0.81*6.87±1.14#7.14±0.52#5.26±0.78△

2.3 各实验组Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平的比较

采用 Western-blot法检测 Caspase-3、Caspase-9蛋白水平，用Gel-ProAnalyzer分析软件分析通道蛋白的灰度值。与假手术组比较，缺血/再灌注组Caspase-3、Caspase-9蛋白增加，差异有统计学意义（P<0.01）；与缺血/再灌注组比较，缺血/再灌注+依达拉奉组、缺血/再灌注+乌司他丁组心肌Caspase-3、Caspase-9蛋白明显降低（P<0.05）；缺血/再灌注+依达拉奉+乌司他丁组优于缺血/再灌注+依达拉奉组、缺血/再灌注+乌司他丁组，差异有统计学意义（P<0.01）（表3）。

表3 各实验组Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平的比较（±s，10）

表3 各实验组Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平的比较（±s，10）

与假手术组比较，*P<0.01；与缺血/再灌注组，#P<0.05；与缺血/再灌注+依达拉奉组、缺血/再灌注+乌司他丁组比较，△P<0.01

组别 Caspase-3 Caspase-9假手术组缺血/再灌注组缺血/再灌注+依达拉奉组缺血/再灌注+乌司他丁组缺血/再灌注+依达拉奉+乌司他丁组0.142±0.125 1.743±0.318*0.642±0.227#0.713±0.437#0.504±0.329△0.227±0.024 1.272±0.408*0.824±0.346#0.716±0.351#0.624±0.115△

3 讨论

MIRI患者心肌再灌注过程中细胞凋亡及氧自由基爆发性产生是造成再灌注损伤的主要因素之一，也是内皮细胞损伤的主要机制[5-6]。本实验制作大鼠缺血/再灌注模型，并给予依达拉奉、乌司他丁干预处理，发现药物处理后，可以减轻氧化应激、降低心肌细胞凋亡指数，联合治疗组优于单独药物治疗组。

心肌缺血/再灌注时随着大量氧的涌入，致使氧自由基大量产生，使膜电位不稳定，触发严重的心律失常[7-8]。缺血心肌再灌注时产生的大量氧自由基是导致心肌缺血/再灌注的主要因素。缺血/再灌注后由于氧自由基、髓过氧化物酶及弹性蛋白酶的大量产生和许多炎症介质如激活的补体C5a、白介素、肿瘤坏死因子（TNF）等大量释放[9-10]，产生炎症反应，诱导中性粒细胞穿内皮迁移以及对缺血心肌的浸润及损伤。依达拉奉是自由基最强的清除剂[11]，通过清除自由基起到抑制细胞膜过氧化作用[11-12]。乌司他丁是从健康人尿中提取精制的糖蛋白，研究表明乌司他丁对于降低炎性介质白细胞介素-6和白细胞介素-8有明显的作用[13]，能减轻炎症反应。

本实验发现依达拉奉、乌司他丁及联合干预处理后，心肌细胞凋亡指数下降，同时凋亡因子Caspase-3、Caspase-9蛋白表达下降。Caspase-3是凋亡发生过程中所需要的一种重要的蛋白酶，也是介导细胞凋亡的核心蛋白酶。在某些应激损伤因素下，可激活Caspases的启动子，主要是Caspase-9，Caspase-9接受到凋亡活化信号后通过被酶催化或自剪接而激活然后引起Caspase级联反应。Caspase-9在级联反应的上游，活化的Caspase-9进一步激活其下游的Caspase-3促使细胞发生凋亡[14]。通过GSH、MDA的检测，提示依达拉奉及乌司他丁均具有抗氧化损伤的作用，并且两药合用具有协同作用。凋亡因子Caspase-3、Caspase-9蛋白表达下降，心肌细胞凋亡指数降低，两药均可以通过抗氧化损伤，减少细胞凋亡的途径，对大鼠缺血/再灌注心肌起到保护作用。联合药物治疗组优于单独药物治疗组，合用可以同时发挥依达拉奉清除氧自由基的能力及乌司他丁改善炎症反应的作用，更好地改善MIRI，值得进一步研究，并应用于临床。

[1]刘胜中.心肌缺血/再灌注损伤机制研究进展[J].实用医院临床杂志，2007，4（1）：88-90.

[2]李凯.心肌缺血/再灌注损伤与心肌细胞凋亡的研究进展[J].医学综述，2008，14（1）：6-8.

[3]Ito T，Muraoka S，Takahashi K，et al.Beneficial effet of taurine treatment against doxorubic induced cardiotoxicity mice[J].Adv Exp Med Biol，2009，12（7）：65-74.

[4]赵秀梅，孙胜，刘秀华.垫扎球囊法复制大鼠在体心肌缺血/再灌注模型[J].中国微循环，2006，10（3）：206-208.

[5]Chen JX，Zhao T，Huang DX.Protective effects of edaravone against cobalt chloride induced apoptosis in PC12 cells[J].Neurosci Bull，2009，25（2）：67-74.

[6]Isotani E.Pathophysiology of acute respiratory distress syndrome[J].Crit Care Med，2012，40（7）：2233-2234.

[7]Koid SS，Ziogas J，Campbell DJ.Aliskiren reduces myocardial ischemia-reperfusion injury by a bradykinin B2receptor-andangiotensinAT2receptor-mediated mechanism[J].Hypertension，2014，63（4）：768-773.

[8]Cao L，Huang C，Wang N，et al.ET-1/NO：a controversial target for myocardial ischemia-reperfusion injury[J].Cardiology，2014，127（2）：140.

[9]Hadi NR，Al-Amran F，Yousif M，et al.Antiapoptotic effect of simvastatin ameliorates myocardial ischemia/reperfusion injury[J].ISRN Pharmacol，2013，2013：815094.

[10]Poh KK，Xu X，Chan MY，et al.Safety of combination therapy with milrinone and esmolol for heart protection during percutaneous coronary intervention in acute myocar dial infarction[J].Eur J Clin Pharmacol，2014，70（5）：527-530.

[11]Yang T，Zhang J，Sun L，et al.Combined effects of a neutrophil elastase inhibitor （sivelestat sodium）and a free radical scavenger （edaravone） on lipopolysaccharide-induced acute lung injury inrats[J].Inflamm Res，2012，61（6）：563-573.

[12]Kawasaki T，Ishihara K，Ago Y，et al.Edaravone （3-methyl-1-phenyl-2-pyra-zolin-5-one），a radical scavenger，prevents 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrah-ydropyridine-induced neurotoxicity in the substantia nigra but not the striatum[J].J Pharmacol Exp Ther，2007， 322（4）：274-282.

[13]Song JE，Kang WS，Kim DK，et al.The effect of ulinastatin on postoperative blood loss in patients undergoing open heart surgery with cardiopulmonary bypass[J].J Int Med Res，2011，39（4）：1201-1202.

[14]Martin JG，Jo T.Genetic differences in airway smooth muscle function[J].Proc Am Thorac Soc，2008，5（1）：73-79.

The influence of edaravone combined with ulinastatin on ischemia/reperfusion myocardial cell apoptosis in rats

WANG Yuan-yuan1CAO Jian2▲ DENG Li1CHEN Qin1OUYANG Xian-guo1
1.Department of Cardiology,the Third Hospital of Nanchang City,Nanchang 330009,China;2.Department of Anesthesiology,the Second Affiliated Hospital to Nanchang University,Nanchang 330006,China

ObjectiveTo explore the influence of edaravone combined with ulinastatin on ischemia/reperfusion myocardial cell apoptosis in rats.Methods 50 cases of experimental rats were randomly divided into sham group,ischemia/reperfusion(I/R)group,I/R+edaravon group,I/R+ulinastatin group and I/R+edaravon+ulinastatin group.The experimental model of myocardial ischemia/reperfusion in rats was established by ligating coronary artery with capsule.The content of myocardial tissue glutathione (GSH)and malondialdehyde (MDA)were determined.The cell apoptosis was detected by TUNEL and the expression of apoptosis factors Caspase-3 and Caspase-9 were determined by Western-blot.ResultsCompared with sham group,GSH in I/R group reduced remarkably(P<0.01),MDA and myocardial apoptotic index significantly increased (P<0.05),the expression of Caspase-3 and Caspase-9 enhanced (P<0.01);Compared with the I/R group,GSH in each drug group improved(P<0.05),MDA and myocardial apoptotic index significantly decreased(P<0.05),the expression of Caspase-3 and Caspase-9 decreased(P<0.05),the combined drug treatment group was superior to the single drug treatment group(P<0.01).ConclusionEdaravone combined with ulinastatin has the effect of anti-myocardial ischemia/reperfusion injury.The mechanism may be related to the regulation of apoptosis mediated by Caspase-3 and Caspase-9.

Myocardial ischemia/reperfusion injury;Apoptosis;Edaravone;Ulinastatin

R541

A

1674-4721（2014）04（c）-0018-04

江西省卫生厅科技计划（20142041）▲

2014-03-03 本文编辑：郭静娟）