刘娜，袁宝珠

重组蛋白产品，即通过 DNA 重组技术使目的基因在相应宿主细胞中表达所获得的蛋白产品。其中，E.coli 源的占 42%，酵母源的占 21%，中国仓鼠卵巢（Chinese hamster overy，CHO）细胞源的占 29%。而在与治疗和预防相关的重组蛋白中，CHO 细胞源的已近 70%[1]。

CHO 细胞是在 1957年由美国科罗拉多大学Theodore T.Puck 从一成年雌性仓鼠卵巢中分离获得的，其增殖快，在体外传代上百次后仍保持增殖能力[2]。该细胞染色体数为 22 条，性状和带型特征独特，因此早期多被用于遗传学研究。

在表达重组蛋白方面，与 E.coli、酵母菌相比，CHO 细胞具有相对完善的蛋白质翻译后修饰系统。此外，由于生物技术发展和高产筛选方法的逐步优化，CHO 细胞已成为目前表达重组蛋白最为理想的细胞基质[3]。然而，现阶段 CHO细胞的重组蛋白产品的产量及活性尚无法完全满足市场需求，传统的改良手段已很难再提高 CHO 表达重组蛋白的能力。而细胞工程技术，特别是基因沉默（RNAi）技术，具有提高重组蛋白产量和（或）活性的巨大潜力。然而，在我国尚未见到利用此策略改造 CHO 细胞的报道。本文就CHO 细胞改造，尤其是基于 RNAi 技术的改造作简要综述，为我国建立自主知识产权的细胞系奠定基础。

1 CHO 细胞生物学特性

1.1 适于重组蛋白表达的生物特性

CHO 细胞很少分泌内源性蛋白，但可高表达成熟的外源蛋白。综合起来，CHO 细胞适于重组蛋白表达的主要生物学特征如下[4]：

⑴翻译后修饰功能：该功能使蛋白在分子结构、理化特性和生物功能方面接近于天然蛋白。CHO 可确保所表达的外源蛋白正确折叠，并具有很高的生物学活性。如CHO 细胞表达的人 sApo2L-Fc 融合蛋白，生物活性可高达 105IU/mg[5]。

⑵适应悬浮培养的能力：CHO 细胞易于从贴壁生长状态转变为悬浮生长状态（驯化-adaptation）。经悬浮培养后，每天的平均比生长速率由最初的 0.27 提高到 0.48，而目的蛋白的活性则可提高 300% 以上[6]。

⑶外源重组基因高效扩增和表达的能力：目前已有二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）和谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）基因缺失的 CHO 变异体[7]。这两种变异体分别经甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）或蛋氨酸亚氨基代砜（methionine sulfoximine，MSX）强化筛选后，可增加重组蛋白的基因拷贝数，从而提高表达水平[8]。例如，当 MTX 浓度为 1.0 μmol/L 时，重组 IgG-E3.3的表达量提高 1 倍，并且生物活性也随之增强[9]。

⑷产物胞外分泌功能：如在 CHO 细胞中选择合适的信号肽后，重组蛋白（以荧光素酶为例）的产量可提高1.5 倍[10]。该特性大大简化了生产工艺下游的蛋白分离和纯化过程[1]。

1.2 CHO 细胞生产的重组蛋白产品

1987年，血纤维蛋白溶酶原激活剂（activase，r-tPA）在 CHO 细胞中首次成功表达，并获得美国 FDA 批准用于临床，标志着以 CHO 细胞为基础的生物制药时代的到来[11]。

目前国内批准上市的治疗产品有重组人促红细胞生成素（EPO）、重组人 II 型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白、重组人表皮生长因子衍生物等产品。在预防类产品中，主要是重组乙型肝炎疫苗。而 EBV 疫苗、艾滋病疫苗等的研发，也都在 CHO 细胞中取得了一定的进展。

2 CHO 细胞改造策略

为提高 CHO 细胞生产重组蛋白的产量和（或）活性，人们已对 CHO 细胞培养条件、表达载体系统及对 CHO细胞本身进行了多方面、多水平的改造。主要的改造策略可以分为传统改造策略和细胞工程改造策略。

2.1 传统策略

传统的策略主要包括：①改良培养基成分：如使用丁酸钠，该方法可明显提高 CHO 细胞合成重组蛋白的产量[12]，但丁酸钠浓度高时却可加速细胞的凋亡；②建立无血清培养（SFM）方法[13]：该策略虽降低产物纯化成本和减少血制品带来的潜在危害性，但 SFM 往往导致细胞活力差，贴壁性差，外源蛋白分泌能力差等缺点；③载体优化：构建含有强启动子的重组载体[14]，如在表达载体中加入泛染色体开放元件（universal chromatin opening elements，UCOE）序列[15]，或是内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES）序列[16]，以提高目的基因转录效率。但上述策略并非从改进宿主细胞自身生物学特性着手，因此改良效率有限。

2.2 细胞工程策略

近年来，人们开始通过细胞工程技术对 CHO 细胞进行改造。细胞工程技术，主要指应用不同的分子生物学手段，改变不同类型细胞生物学功能的基因结构或表达水平，特别是通过基因敲除、基因过表达或基因沉默等影响与特定生物学功能相关基因的表达水平的技术，以获得特定生物学功能发生改变的细胞[17]。而在 CHO 细胞的应用研究中，主要利用改变与重组蛋白表达量或活性相关生物学功能基因表达水平的策略，提高目的重组蛋白的产量或活性。

基因敲除，为经同源重组或锌指核酸酶等介导，从基因组中敲除特定基因序列的技术策略[18]。例如，通过构造具有特异性的锌指核酸酶，特定敲除谷氨酰胺合成酶基因，建立 GS 缺失细胞系[7]。由于该技术相对较为复杂，所以在CHO 细胞改造过程中，人们更多地选择灵活性更强的基因过表达和基因沉默策略。

基因过表达技术，即是通过基因转染结合强启动子的使用，使特定基因高水平持续表达以获得相应细胞生物学特性的技术。例如，可以通过基因转染 CHO 细胞，提高 Hsp70、Hsp40 的表达，促进重组蛋白抗体的折叠和分泌，实现重组蛋白生产的优化[19]。另外，通过抗凋亡蛋白的过表达，提高细胞对凋亡的抗性而延长生存时间，也可以实现重组蛋白产量的提高。如将外源 Bcl-2 抗凋亡基因转入 CHO 细胞，实现该蛋白过表达，提高抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白的相对比值，可有效抑制细胞凋亡，进而提高目的重组蛋白（如hTPO）的产量[20-21]。

基因沉默，即通过降低基因转录水平和转录产物的稳定性等方法，以关闭部分或全部基因的表达，从而获得具有目的性状的细胞。该策略一般经 RNA 干扰（RNA interference，RNAi）技术来实现。RNAi 技术作用机制类似于内源途径产生的 microRNA，可特异降解靶基因 mRNA。通过导入与靶基因 mRNA 特定区域互补的小分子 siRNA，经互补配对可在细胞内形成 RISC（RNA induced silencing complex），进一步引起靶 mRNA 的降解或者阻止翻译的进行[8]。尽管CHO 细胞内源 miRNA 表达谱日渐清晰[22]，但是内源miRNA 并非按照人们意愿发挥作用，因此，利用 RNAi 技术靶向调节不同基因表达很有必要。目前，RNAi 可以简单地分为以下两类：将外源合成的 siRNA 通过质脂体等转染细胞，实现瞬时干扰靶基因的表达（此方法多用于验证RNAi 策略的有效性）；或是经载体（如质粒 DNA 载体或病毒载体）携带表达 siRNA 特定 DNA 片段（shRNA）转染或感染细胞，在细胞内产生 siRNA，长期稳定地抑制靶基因的表达，此方法可用于建立新的稳定细胞系[8]。

利用基因沉默从不同的细胞生物学角度改造 CHO 细胞的主要策略包括以下 5 种：①减弱或破坏细胞凋亡机制；②影响细胞糖基化修饰功能[23]；③降低二氢叶酸还原酶活性[7]；④干扰乳酸脱氢酶 A 亚基表达[24]；⑤稳定细胞骨架蛋白[25]等。而此处详细介绍减弱细胞凋亡机制的策略。

生产用细胞经长时间大规模培养后，有害代谢物的累积以及必要营养成分的降低都可能诱导细胞凋亡，这也极可能是影响重组蛋白产量提高的瓶颈之一。细胞内除凋亡酶（如启动凋亡酶 caspase-8、9、10，效应凋亡酶 caspase-3、7）外，还存在多种促进凋亡的蛋白分子，如 Bax、Bak、Bad、Bim 等凋亡蛋白。凋亡诱导信号，经内外源通路及级联反应（cascade）的方式逐级放大，最终导致细胞死亡[26]。

利用 RNAi 技术抑制凋亡过程的发生，可选择不同的凋亡酶作为靶分子。例如通过 RNAi 技术抑制 caspase-3、caspase-7 的表达，可以有效降低丁酸钠对 CHO 细胞的诱导凋亡作用，更为重要的是当两种凋亡酶表达经同时导入两个 RNAi 而发生同时降低时，目的蛋白 hTPO 的表达产量显著提高（55%）[27]；但是当单纯抑制 caspase-3 的表达，目的蛋白的表达量只提高了 16%[28]。

除凋亡酶外，也可选择其他促凋亡蛋白作为 RNAi 技术的候选靶分子。有报道发现，通过选择 Bak和 Bax 作为RNAi 靶蛋白的策略来改造 CHO 细胞，Bak 和 Bax 的表达同时降低，细胞对凋亡的抵抗能力增强 1.6 倍，同时目的蛋白（IFN-γ）的产量提高了 35%[29]。另外的例子是通过RNAi 技术干扰 Agl-2、Requiem 这两个凋亡早期基因，并配合其他抗凋亡蛋白的过表达，可使 CHO 细胞合成目的蛋白（IFN-γ）量提高 2.5 倍[30]。因此，由于细胞内存在多个促进凋亡的蛋白，所以可根据情况选择不同的蛋白作为RNAi 的靶分子，增强 CHO 细胞的抗凋亡能力，最终提高目的蛋白的产量。

除抑制凋亡机制外，其他通过 RNAi 技术提高重组蛋白表达量或活性的策略包括：①降低 α-1，6 岩藻糖基转移酶基因（Fut8）的表达（改造后的细胞 Fut8 基因的表达水平只有原来的 20%），进而降低目的重组抗体的岩藻糖糖基化程度，其结果为提高抗体 Fc 段与其受体的亲和力，减少血浆成分中对目的重组抗体相关 ADCC 活性的限制，最终可提高目的抗体 ADCC 的活性百倍以上[23]；②建立新的DHFR 低表达的细胞系：利用 RNAi 技术降低 DHFR 表达所建立的新 CHO 细胞系较传统基因敲除方法效率更高，因此能建立新的更有效的 DHFR 缺陷的 CHO 细胞株[8]；③限制乳酸脱氢酶（LDH）A 亚基基因的表达，抑制糖酵解中丙酮酸向乳酸的转化，提高 CHO 细胞对培养过程中乳酸积累所致凋亡的抵抗性，进而提高目的重组蛋白（如TPO）的产量[24]；④通过降低 Cofilin 的表达维持细胞骨架蛋白的稳定性，可从多方面（如促进基因转录、减少凋亡等）增加细胞活性，进而改善细胞合成外源重组蛋白的功能（如碱性磷酸酶 SEAP 的表达量可提高 60% 以上[25]）。

3 小结

长期以来，为提高目的重组蛋白的产量和活性，人们已经对 CHO 细胞进行了多方面的改造。在多种改造策略中，以 RNAi 技术为基础的基因沉默策略，由于其操作简便、稳定、灵活及效率高等优点，较传统改造策略更具有技术上的优势，并能从细胞工程的角度对细胞进行改造，因此必将是目前及未来改造 CHO 细胞和不断提升其重组蛋白生产能力的主要技术策略。

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