马正南，李勤凡，耿果霞

（1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌712100；2.西藏林芝地区职业技术学校，西藏林芝860000）

甘草是一种重要的中药，可以分离出内生真菌，内生真菌能产有关活性物质如甘草酸、甘草次酸、黄酮、生物碱等多种成分，其中甘草酸和黄酮是最重要的活性成分。甘草酸具有抗病毒、抗炎及免疫调节等作用。黄酮具有抗炎、抗病毒、利胆、强心、镇静和镇痛等作用。甘草黄酮的获得主要是从野生或者种植甘草中提取的。由于干旱、过度采挖等原因，造成甘草资源短缺，来源不足。所以，积极寻求一种新的黄酮来源是具有重大意义的研究工作。内生菌是指在其生活史的部分或全部阶段都生活在植物组织内的细菌、真菌或放线菌，且不会引起植物病害。植物内生菌能独立产生丰富的次生代谢产物，是天然产物的重要来源和具有高度开发价值的新型生物资源［1］，其次生代谢产物的检测的常见方法有酶法、气相色谱法以及高效液相色谱法（HPLC）。其中，HPLC由于样品前处理简单、直接进样，更加快捷和准确成为目前应用最多的色谱分析方法［2］。芦丁作为黄酮类的主要成分，很早就被通过层析色谱法从植物中分离［3］。有学者采用高效液相色谱法证明了植物的抗氧化性作用是芦丁成分［4］，说明芦丁的作用以及通过HPLC 检测芦丁的可行性。但是目前尚未见关于HPLC 检测植物内生真菌产芦丁的条件优化的文献报道。本试验以甘草内生菌的研究为依托，通过对不同流动相、柱温、流动相流速、波长、进样体积等条件的优化筛选探索内生菌代谢产物中黄酮（主要是芦丁）成分HPLC 测定最优化组合条件，为后期通过微生物途径开发芦丁来源提供更多新的候选资源以适应生产需要，还可以为后续从其他植物（如槐米、黑麦等）利用HPLC 法筛选产芦丁内生真菌的研究提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

甘草内生真菌处理样品溶液制备：参照文献的分离方法［5］从宁夏野生甘草中分离出内生真菌，对分离的内生真菌采用纯化、纯培养、刮菌丝、对菌丝进行有效物质的提取制备得到样品提取液作为试验材料。

1.2 试剂与仪器

芦丁标准品色谱级（≥98%），购自阿拉丁试剂公司；色谱级甲醇，美国Fisher公司；乙腈，广东光华科技股份有限公司。

美国Waters高效液相色谱仪；Breeze2工作站；Waters2489 紫外／可见光检测器；Symmetry columns C18（5μm，4.6 mm ×250 mm）色谱柱。FR－200紫外可见成像分析仪（上海复日科技公司）；TE2101－L电子天平，北京赛多利斯仪器有限公司

1.3 芦丁标准品溶液的制备

用电子天平准确称取真空干燥至恒重的芦丁对照品4.2mg，用甲醇溶解，稀释，配制成10mL含芦丁0.42mg／mL的标准溶液作为母液。然后分别准确移取0.25、2、1、0.5、0.25mL母液置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至0.5、5、5、5、5mL，得到浓度为0.21、0.168、0.084、0.042、0.021mg／mL的浓度梯度溶液，用0.45μm 微孔滤膜过滤后备用。

1.4 试验方法

通过初步试验筛选出一株产芦丁的甘草内生真菌，以芦丁标准品作为参照物，分别设定不同柱温、检测波长、流动相、流动相流速、进样量来进行HPLC试验，找到HPLC筛选产芦丁内生真菌的优化条件。

2 结果与分析

2.1 温度变化对HPLC的影响

高效液相色谱设定条件为：流动相流速1.0 mL／min，流动相A：B ＝0.2：0.8，进样体积V＝10 μL 波长λ＝260nm，检测结果见表1。

表1 温度变化对HPLC的影响Table 1 Influence of temperature on HPLC

当其他条件固定时随着温度的增加在检测样品和标准品时色谱柱的柱压逐渐减少，由2329psi降低到1576psi。样品和标品的出峰保留时间逐渐提前，由7.1min提前到5.2min左右，并呈现规律性递减。当选取温度为50 ℃时标准品和样品的液相图如图1。

图1 在50 ℃条件下芦丁标准品和菌丝提取液的HPLC分析Fig.1 HPLC analysis of standard rutin and mycelium extraction in 50 ℃

2.2 流动相变化对HPLC的影响

高效液相色谱设定条件为：流动相流速1.0 mL／min，流动相A：B ＝0.2：0.8，流动相A1为乙腈，流动相A2为甲醇，流动相B 为0.05%磷酸，进样体积V＝10μL 波长λ＝260nm 柱温T＝40℃，检测结果见表2。

表2 流动相变化对HPLC的影响Table 2 Influence of mobile phase on HPLC

当其他条件固定时根据流动相极性大小关系改变流动相会影响色谱图的效果。当选取甲醇作为流动相时，样品和标准品检测柱压在3562psi－3655 psi范围内变化。样品和标准品的出峰时间也维持在2.5min左右。而换成是乙腈作为流动相时，样品和标准品检测柱压在1859psi－1882psi范围内变化。样品和标准品的出峰时间也维持在5.8min左右。比较后发现，尽可能选取柱压比较小、出峰时间比较延迟些的流动相作为试验流动相，所以尽可能选取乙腈作为流动相进行试验，具体液相图如图2。

图2 在流动相为乙腈条件下芦丁标准品和菌丝提取液的HPLC分析Fig.2 HPLC analysis of standard rutin and mycelium extraction in mobile phase of acetonitrile

2.3 流动相A：B流速比例变化对HPLC的影响

流动相流速为1.0mL／min。进样体积V＝10 μL 波长λ＝260nm 柱温T＝40 ℃（表3）。

当其他条件固定时改变流动相流速会影响色谱图的出峰效果。当改变流动相A∶B流速时样品和标准品检测柱压和出峰时间随着流动相比例逐渐增大而出现先升高后降低的现象。在流动相比例为0.20∶0.80时出现最大出峰时间5.80min（图3）。

表3 流动相A∶B流速变化对HPLC的影响Table 3 Influence of mobile phase A∶B speed on HPLC

图3 在流动相比例为0.2∶0.8条件下芦丁标准品和菌丝提取液的HPLC分析Fig.3 HPLC analysis of standard rutin and mycelium extraction in 0.2∶0.8of mobile phase

2.4 进样体积变化对HPLC的影响

高效液相色谱设定条件为：流动相流速1.0 mL／min，流动相A：B ＝0.2：0.8，波长λ＝260nm柱温T＝40℃，检测结果见表4。

当其他条件固定时改变进样体积后获得的液相色谱图和改变之前获得图基本一致。由此可以初步断定进样体积的改变不会对液相色谱图产生影响。所以在试验中为了方便条件统一，选取进样体积为20μL为合适的进样体积进行后续试验。

表4 进样体积变化对HPLC的影响Table 4 Influence of injection volume on HPLC

2.5 波长变化对HPLC的影响

高效液相色谱设定条件为：流动相流速1.0 mL／min，流动相A：B ＝0.2：0.8，进样体积V＝10 μL 柱温T＝40℃，检测结果见表5。

首先对芦丁标准品溶液在紫外可见成像分析仪上进行一次全波段扫描，从图4可以看出，芦丁标准品的紫外检测波长大约在260nm 和360nm。所以试验选取了这两个波长作为检测波长。

表5 波长变化对HPLC的影响Table 5 Influence of wavelength on HPLC

当其他条件固定时改变检测器的波长后样品和标准品检测柱压和出峰时间几乎没有什么变化，一直持续在柱压1575psi左右，出峰时间持续在5.20 min左右。

通过HPLC检测，菌丝提取液在设定条件下与标准品的保留时间几乎一致，芦丁标准品的出峰时间是5.794min（图6A），样品出峰时间为5.813min（图5B）。设定条件∶流动相为A：乙腈、流动相B∶0.05%磷酸、柱温T＝50℃、流动相比例有机相A（乙腈）：水相B（0.05%磷酸）＝0.20∶0.80、流动相流速为1mL／min、波长λ＝360nm、进样体积V＝20μL，得到的液相见图5。

图4 芦丁标准品的紫外吸收光谱图Fig.4 Ultra Violet Spectrophotometry of standard rutin

图5 芦丁标准品和GC11a菌丝提取液的HPLC分析A.芦丁标准品；B.GC11a菌丝提取液Fig.5 HPLC analysis of standard rutin and mycelium extraction of GC11aA.Standard of rutin；B.Mycelium extraction of GC11a

3 讨论

植物历来是筛选天然药物最主要的原料，但是由于植物的过度使用，使得许多药用植物濒临灭绝。为了解决资源问题，药用植物新资源研究的热点已集中在药用植物内生真菌上［6］。研究结果表明植物内生真菌能够产生与宿主相同或相似的生理活性成分［7］。

近年来，利用内生真菌获得药物活性成分的研究已经有很多，但是，在研究过程中发现，在利用高效液相色谱法进行试验的同时，因为条件设置不同造成很多文献报道的同一种物质的实验数据不一致（主要是出峰时间不一致）。本试验中，首先从对温度改变的实验数据可以发现，适当的提高温度可以很好的降低柱压，从而延长色谱柱的使用寿命，但另一方面考虑到甲醇等提取溶剂的溶沸点大小、液相色谱柱的温度耐受程度和其他一些因素的影响，也不能无限制提高柱温。所以，经过优化发现，比较好的柱温应该设定在50℃。从流动相条件观察发现，选取甲醇作为流动相时，柱压较高，接近极限值4000psi，而乙腈作为流动相时柱压维持在1859 psi－1882psi范围内，所以为了保护色谱柱，延长使用寿命，选择乙腈作为流动相。从流动相比例变化情况看，随着流动相比例增大，柱压和出峰保留时间呈现先低后高再低的规律，当选取0.2∶0.8作为流动相流速比例时有最大出峰保留时间出现，而且此时的柱压也比较接近液相平衡基线时候的柱压1800psi附近，所以应该选择流动相流速比例为0.2∶0.8 的比例进样。从进样体积变化和波长变化看，对样品和标准品的出峰时间以及柱压都几乎没有影响，但是从液相图中样品的出峰面积来看，选择360nm 作为检测波长比较有利于分离样品。所以选取20μL作为进样体积、波长选取360nm 作为扫描波长。

在本试验中，通过建立高效液相色谱法定性定量检测内生真菌产芦丁的优化组合方法，制定最优组合（波长、流动相、流速等因素）的试验方法，使得出的实验数据具有科学性，最大限度排除因试验设置条件造成的实验误差，为后续相关科研研究奠定基础。

4 结论

由本试验可以得出，高效液相色谱法定性定量检测内生真菌产芦丁的优化组合方法条件为：流动相A 为∶乙腈、流动相B 为∶0.05%磷酸、柱温T＝50℃、流动相比例有机相A（乙腈）：水相B（0.05%磷酸）＝0.20∶0.80、流动相流速为1mL／min、波长λ＝360nm、进样体积V＝20μL。

［1］包丽霞，殷 瑜，杨 天，等.北细辛内生真菌的分离鉴定及代谢产物的生物活性［J］.微生物学杂志，2010，30（5）：1－6.

［2］刘宇鹏，郑 璞，孙志浩.采用离子排斥色谱法分析发酵液中的琥珀酸等代谢产物［J］.食品与发酵工业，2007，32（12）：119－123.

［3］Carnat A－P，Carnat A，Fraisse D，et al.Violarvensin，a new flavone Di－C－glycoside from viola arvensis［J］.Journal of Natural Products，2008，61（2）：272－274.

［4］Goncalves A F K，Friedrich R B，Boligon A A，et al.Anti－oxidant capacity，total phenolic contents and HPLC determination of rutin in Viola tricolor（L）flowers［J］.Free Radicals and Antioxidants，2012，2（4）：32－37.

［5］Yang K，Liang J，Li Q，et al.Cladosporium cladosporioides XJ－AC03，an aconitine－producing endophytic fungus isolated from Aconitum leucostomum［J］.World Journal of Microbiology ＆Biotechnology，2013，29（5）：933－938.

［6］董静洲，易自力，蒋建雄.我国药用植物种质资源研究现状［J］.西部林业科学，2005，34（2）：95－101.

［7］王 军，林永成，吴雄宇，等.从南海红树内生真菌No.2533分离出新的异香豆素［J］.中山大学学报：自然科学版，2001，40（1）：127－128.