丁 宁 康 乐 高 明 孙文鹏

复方儿茶止泻霜对番泻叶致泻大鼠结肠水通道蛋白3表达的影响*

丁 宁①*康 乐②高 明②孙文鹏②

目的：探讨复方儿茶止泻霜对番泻叶致泻大鼠模型结肠组织水通道蛋白3(AQP-3)表达的影响。方法：将50只SD大鼠随机分为空白组、阴性对照组、阳性对照组、高剂量组和低剂量组5组，每组10只。模型建立成功后取大鼠结肠组织，应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质Western blot印迹法检测各组动物结肠AQP-3的表达水平。结果：RT-PCR和Western blot结果显示一致，高剂量组、低剂量组结肠AQP-3 mRNA和蛋白表达水平与阴性对照组、空白组比较均增多，高剂量组增加显著(F=48.687，P＜0.05)；高剂量组与阳性对照组相比较，其差异无统计学意义。结论：复方儿茶止泻霜对番泻叶致泻大鼠结肠AQP-3蛋白的表达有上调作用，且呈一定剂量的依赖性。

复方儿茶止泻霜；结肠；水通道蛋白3；腹泻

[First-author’s address] Department of Biochemistry, Medical College of Dalian University, Dalian 116622, China.

复方儿茶止泻霜(compound catechu antidiarrhea ointment)是近年来中医治疗腹泻研究领域的热点药物之一，其治疗腹泻的药效学研究取得了一定的进展，但分子作用机制尚不明确[1-2]。目前发现哺乳动物体内有13种水通道蛋白(AQPs)，其中水通道蛋白3(aquaporin 3，AQP-3)在结肠、直肠中广泛分布，且与腹泻发病的水代谢紊乱密切相关[3]。本实验研究采用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)观察了复方儿茶止泻霜对番泻叶(Folium sennae)致泻大鼠结肠AQP-3蛋白表达的影响，为复方儿茶止泻霜进一步应用于临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SD雄性大鼠50只，10周龄，体重(220±10)g，由大连医科大学实验动物中心提供[合格证号：SCXK (辽)2008-0002]。

复方儿茶止泻霜(批号：20111001)，高剂量含生药量0.58 ggg-1基质；低剂量含生药量0.34 ggg-1基质，由大连大学中医药研究所提供；盐酸小檗碱片(批号：110631)，东北制药总厂生产；免抗AQP-3多克隆抗体购自Santa Cruz Technology公司；HRP标记的山羊抗兔IgG抗体购自北京中杉金桥公司；RIPA蛋白裂解液、Bradford定量及ECL发光试剂盒购自碧云天生物公司；Trizol及反转录试剂盒购自大连宝生物公司。

1.2 动物分组及模型建立

将SD大鼠50只分为阴性对照组、空白组、阳性对照组、高剂量组和低剂量组5个组，每组10只。模型建立主要步骤为：①阳性对照组灌胃15 mg/ml小檗碱药液；②高剂量组和低剂量组连续3 d分别于早晚涂抹3 g高、低剂量样品；③实验第10 d时除空白对照组外其他各组灌服番泻叶提取液20 ml/kg(1次/d)，观察记录大鼠粪便印迹及腹泻次数，直到建模成功[4]。

1.3 RT-PCR检测目的蛋白

(1)大鼠总RNA的提取及保存。提取各组大鼠结肠(距肛门约11～13 cm处)组织块约100 mg，加入Trizol试剂1 ml(Trizol试剂与结肠组织体积比约为10∶1)，匀浆5 min，加入0.2 ml氯仿，混匀静置后于4 ℃以12000 r/min离心15 min；取上清液加入等体积异丙醇，混匀后室温静置10 min，于4 ℃以12000 r/min离心10 min；弃上清，加入75%乙醇1 ml，于4 ℃以12000 r/min离心5 min；弃上清，漂洗2次沉淀。干燥5 min，加入DEPC处理水50 μl，55 ℃温育10 min，溶解后-80 ℃冻存。取3 μl RNA稀释后分光光度计260 nm处读取数值且A260/A280=1.8～2.2间可用，总RNA浓度=A260×4(μg/μl)，用前调整至1 μg/μl。

(2)逆转录反应。提取大鼠总RNA 2 μg，随机引物0.5 μg，70 ℃温育5 min后放置冰上，加入RT反应体系(含逆转录反应缓冲液、dNTPs、AMV逆转录酶)，混匀后短暂离心，加入PCR仪，反应条件为42℃ 30 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。

(3)PCR反应。选用GAPDH基因为内参照引物基因，反应中所用上游引物为5’-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3’，下游引物为5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，扩增产物为308 bp。AQP-3上游引物为5’-CCTCTGGACACTTGGATATGG-3’，下游引物为5’-CAGCTTCACATTCTCTGCCTC-3’，扩增产物为398 bp。AQP-3反应条件为94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环；GAPDH反应条件为94℃ 20 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环。取每组PCR扩增产物各10 μl，置1%琼脂糖凝胶(含1 μg/ ml DNA green)于TBE电泳缓冲液中(电压电泳4 V/ cm)60 min，采用凝胶成像分析系统进行灰度扫描定量，AQP-3基因与GAPDH比值表示AQP-3 mRNA相对表达量。

1.4 Western blot检测目的蛋白

(1)组织取材与样品制备。将200 mg组织块剪碎，置于5 ml离心管中加1 ml裂解液。使用微型匀浆器进行匀浆，匀浆后置于冰上1 h后10000 g，4 ℃离心10 min。取上清液至1.5 ml管，12000g，4 ℃ 10 min，再次取上清液至新1.5 ml管，-80 ℃储存。

(2)组织蛋白含量的测定。①从-20 ℃取出1 mg/ ml BSA，室温融化备用；②取7个5 ml离心管，分别加入1 mg/mlBSA于0、10 μl、20 μl、40 μl、60 μl、80 μl、100 μl管中，用蒸馏水补足各管至100 μl；③各组样品取5 μl，加蒸馏水95 μl混匀；④各管加考马斯亮蓝G-250溶液2 ml混匀，室温静止2 min。⑤酶标仪比色分析，测定490 nm的光吸收值，测定时浓度由低到高；⑥于Excel根据标准品绘制标准曲线，根据得出的公式计算样本浓度。

(3)Western blot检测蛋白表达。加入预处理样品100 μg进行电泳、转膜，将5%的小牛血清封闭2 h，一抗孵育4 ℃12～16 h，TBST洗涤3次；二抗室温孵育2 h，TBST洗涤4次后ECL显色。经凝胶成像系统扫描生成图像并采用Quantity One软件对其进行灰度分析。

1.5 统计学方法

采用SSPS 13.0软件进行方差分析和LSD检验，计量资料数据以均数±标准差(mean±SD)表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR检测各组动物结肠AQP-3表达水平变化

RT-PCR结果显示，高、低剂量组中结肠AQP-3 mRNA表达水平与阴性对照组、空白组比较均增多，高剂量组较阴性对照组增加显著，其差异有统计学意义(F=48.687，P＜0.05)；高剂量组(0.79±0.13)与阳性对照组(0.83±0.17)相比较无显著差异(见表1)。

表1 AQP-3在mRNA及蛋白表达水平比较(ean±SD)

2.2 Western blot检测各组动物结肠AQP-3表达水平变化

Western blot结果与RT-PCR一致，显示高、低剂量组中结肠AQP-3 mRNA表达水平与阴性对照组、空白组比较均增多，高剂量组较阴性对照组AQP-3表达量显著增加，其差异有统计学意义(F=34.254，P＜0.05)；高剂量组(0.58±0.09)与阳性对照组(0.55±0.12)相比较无显著差异(见表1)。

3 讨论

腹泻是临床消化系统多发病之一，分急性和慢性两类。急性腹泻病因复杂，发病较急，病情进展迅速，属于中医学“泄泻”之“暴泻”范畴，早期合理用药非常重要。目前，临床多采用中西医结合治疗方法，其疗效较好，而复方儿茶止泻霜因其使用方便，适用人群广泛。

复方儿茶止泻霜是复方中药制剂，主要由儿茶、黄柏、五倍子和木香组成，其通过体外透皮吸收后作用于胃肠道，发挥清热燥湿、涩肠止泻的功效，在急慢性腹泻中发挥抗炎止泻及增强免疫力作用[5-6]。本实验前期研究显示，复方儿茶止泻霜剂可以延长肠内容物停留的时间，促进水的吸收，减少粪便水含量[3]。然而，通过调节水通道蛋白而发挥止泻作用的机制尚需进一步实验研究。

AQP-3是消化道主要分布的水通道蛋白，在胃体、小肠及结肠等均有显著的表达[7]。在结肠主要分布于基底膜表面内皮细胞，对维持水代谢平衡有调节作用。大量实验证实，AQP-3高表达可引起结肠黏膜对水重吸收增加而导致便秘，AQP-3的低表达可引起结肠黏膜对水重吸收减少而导致腹泻或便溏[8]。AQP-3在中医中药治疗中的作用一直是研究热点。张晓丹等[9]建立实验动物模型用中药“平胃散”作用后经免疫组化等方法检测发现，分布在胃贲门黏膜的AQP-3减少，与其抑制过多水转运到胃细胞机制相关；分布在小肠中段组织AQP-3的表达升高，与其促使积聚的水吸收排泄、调节肠节律性运动恢复正常以及消化吸收功能恢复密切相关。刘慧慧等[10]用慢性应激结合束缚方法建立腹泻型肠易激综合征大鼠动物模型，进行眼针治疗后用定量RT-PCR分析、免疫组化等方法检测发现，结肠组织中AQP-3的mRNA及蛋白表达明显升高。以上研究表明AQP-3与结肠水代谢紊乱的发生发展关系密切，AQP-3有可能会成为腹泻治疗研究的新靶点[11-12]。

本实验研究采用灌服20%番泻叶提取液方法建立大鼠腹泻模型，是研究急性腹泻发病机制及药物治疗的良好模型[13]。本实验中RT-PCR和Western blot结果均表明，阴性对照组即腹泻模型组其AQP-3表达水平比空白组及复方儿茶止泻霜高低剂量组均显著减少，与Ikarashi等[14]报道一致。而用复方儿茶止泻霜干预发现其高、低剂量组AQP-3蛋白表达水平比空白组及阴性对照组均显著增多。结果提示，复方儿茶止泻霜可上调AQP-3蛋白的表达，是其发挥止泻作用的重要机制之一。但是复方儿茶止泻霜对其上调的具体机制尚不清楚，有待进一步研究[15]。

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Effect on compound catechu anti-diarrhea ointment on the expression of AQP-3 proteinin colon of diarrhea rats

/DING Ning, KANG Le, GAO Ming, et al// China MedicalEquipment,2014,11(8):1-3.

Objective: To investigate the effect of Compound Catechu Anti-diarrhea Ointment on the expression of aquaporin 3(AQP-3)of colonic mucosa of diarrhea rats. Methods: Fifty SD rats were divided into 5 groups, per group for 10 rats, including diarrhea model(DM)group, low dose-(L), and high dose-(H)Water extraction solution of Compound Catechu groups, positive control drug(PC)group, and normal control(NC) group. The expression of AQP-3 protein of colonic mucosa in different groups was determined by RT-PCR and Western blot methods. Results: Western blot and RT-PCR results showed that the expressions of AQP-3 in the colon region of high/low dose group were increased significantly than DM and NC group, AQP-3 of H group were obviously increased than L group(F=48.687, P＜0.05), but similar with the expressions of AQP-3 in the colon region of PC group. Conclusion: Compound Catechu Anti-diarrhea Ointment can increase the expression level of AQP-3 protein in the colon region in diarrhea rats and play a important role in the drug therapy.

Compound catechu anti-diarrhea ointment; Colon; Aquaporin 3; Diarrhea

1672-8270(2014)08-0001-03

R963

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2014.08.001

2014-03-26

国家自然科学基金面上项目(81073011)“复方儿茶止泻霜抗腹泻药效关系及作用机制的研究”

①大连大学医学院医学检验实验中心 辽宁 大连 116622

②大连大学医学院病理生理学教研室 辽宁 大连 116622

*通讯作者：dingning@dlu.edu.cn

丁宁，女，(1977- )，硕士，实验师。大连大学医学院医学检验实验中心，从事肿瘤分子生物学及临床生化检测相关研究。