赖 政，李希茜，2，汪 涯，颜日明，张志斌，朱 笃，*

(1.江西师范大学生命科学学院，江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室，江西南昌330022;2.江西中医药大学科技学院，江西南昌330025;3.江西科技师范大学生命科学学院，江西省生物加工过程重点实验室，江西南昌330013)

0 引言

石杉碱甲(HuperzineA，简称HupA)是20世纪80年代刘嘉森等从石杉科Huperiaceae石杉属Huperzia Bemh珍贵药用蕨类植物蛇足石杉［Huperzia serrata(thumb)Trex.］中率先分离获得的具有抑制乙酰胆碱酯酶活性的新型石松类生物碱，是目前治疗老年痴呆症最具有前景的药物之一［1-2］.由于其还不能工业化合成生产，目前几乎全从石杉科植物蛇足石杉中提取，而蛇足石杉在自然界生长又极其缓慢，植株矮小，HupA含量极低，野生资源十分有限［3-4］.近年来，随着国内外市场对HupA需求的日益增大，蛇足石杉资源遭受了严重的破坏，进而使得自然资源变得极为紧缺［5］.鉴此，为使其得到合理有效的保护和科学持续的利用，开展高含量的优质种源勘探筛查对蛇足石杉人工繁育以及生物工程技术的研究运用都有重大意义.

目前，已有研究报道对我国蛇足石杉中HupA含量进行了初步的测定，但研究多为植株全株的含量测定，而有关植株不同组织部位及时期变化过程中HupA含量的研究较少，其中鲜见采集自我省植株的此类研究报道［6-14］.本研究采用HPLC法系统测定了江西庐山和井冈山蛇足石杉中HupA在不同时期和不同组织部位中的含量，在此基础上探讨蛇足石杉中HupA含量的时空动态变化规律，从而为勘探筛查高含量的优良种源和确定合适的植株采收时机及采集部位提供科学参考依据，对实现有效保护和合理利用蛇足石杉资源具有重要意义.

1 材料与方法

1.1 材料

供试蛇足石杉样品分别于2013年的3月、6月、9月和12月采自江西庐山和井冈山，样品采集的样地及生境见表1.每次采样均选择长势基本相同的植株随机采集约20株，并经江西庐山植物园张乐华研究员鉴定为蛇足石杉，现标本存放于江西师范大学江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室.

1.2 仪器与设备

Waters1525高效液相色谱仪，Waters 2996二极管阵列检测器.RE-25AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，KQ5200超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，GG-17分液漏斗(四川蜀牛玻璃仪器)，电子天平CP114(奥豪斯仪器).

表1 蛇足石杉采样地理位置及生境

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 参照马晓强等［14］的方法，C18柱(5 μm，4.6mm ×150mm)，流动相:甲醇-水-三乙醇胺体积比为60.00∶40.00∶0.02，流速:0.5mL·min-1，柱温 30 ℃，检测波长310 nm，进样量20μL，分析时间15min.

1.3.2 标准品溶液的制备 精密称取HupA标准品5mg于10mL容量瓶中以甲醇溶解并定容，制备成 500 μg·mL-1贮备液，再分别稀释成 10，20，40，60，80 μg·mL-1溶液.

1.3.3 供试品溶液的制备 将采集的新鲜蛇足石杉样品洗净并将根、茎和叶分开，置于50℃烤箱中烘至恒重，粉碎后过40目筛.加入2%的酒石酸30mL，浸泡过夜，超声提取1 h，离心取上清液，取残渣重复上述操作2次，合并滤液.浓缩滤液至原来体积的1/3，用氨水调pH值至9～10.再将上述溶液移至分液漏斗中，用氯仿反复萃取3次.合并氯仿相并浓缩至浸膏，再用10mL甲醇定容，HPLC测定前用0.22 μm滤膜过滤.

1.4 数据分析

对检测获得的数据，按照样地和时期的不同进行归类，用SPSS软件分别进行单因素方差分析，用最小显著差异法LSD检验差异显著性.分析主要包括样地内不同时期植株组织中HupA含量差异性分析、不同样地间相同时期植株中HupA含量显著差异性分析，以及不同样地间植株中HupA含量差异显著性分析.

2 结果

2.1 色谱条件的优化

参照马晓强等的方法，在流动相中加入微量的三乙醇胺，并调低流速，以峰面积按外标法定量分析.蛇足石杉不同组织供试品溶液中HupA出峰时间与标准品溶液相吻合，出峰时间约为10.9min左右，在上述色谱条件下，各组分之间分离良好(见图1).

图1 标准品(A)和12月份庐山(B)及井冈山样品(C)中HupA的HPLC分析图谱

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系 取浓度分别为10、20、40、60、80 μg·mL-1的HupA标准品溶液，按本文1.3.1节所述，分别进样20μL，测定峰面积.以HupA标准品峰面积为纵坐标(y)、HupA标准品浓度为横坐标(x)制定标准曲线(图2)，线性回归方程:y=91403x+7920.2，R2=0.9921.结果表明，HupA 进样量在10～80 μg·mL-1与峰面积呈良好的线性关系.

图2 HupA标准曲线

2.2.2 精密度试验 取40 μg·mL-1HupA标准品溶液，按本文1.3.1节所述，重复进样6次，每次20μL，计算HupA色谱峰面积的相对标准偏差为2.8%，结果表明，仪器精密度良好.

2.2.3 稳定性试验 随机选取1份蛇足石杉供试样品溶液，分别于0、2、4、6、8、10 h，在本文1.3.1 节所述色谱条件下分别进样，计算HupA色谱峰面积的相对标准偏差为2.2%.结果表明，样品溶液在10 h内稳定.

2.2.4 重复性试验 随机选取6份蛇足石杉样品，按本文1.3.3节的方法制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下分别进样，计算HupA色谱峰面积的相对标准偏差为0.51%，结果表明，方法重复性良好.

2.2.5 回收率试验 精密称取已知HupA含量的蛇足石杉样品6份，每份精密加入浓度为50 μg·mL-1的标准品溶液10mL，按1.3.3节方法制备供试品溶液，按1.3.1节色谱条件下进行分析测定，计算回收率，结果HupA的平均回收率为95.58%，相对标准偏差为1.36%(n=6)，实验结果见表2.

表2 HupA加样回收率实验结果(n=6)

2.3 蛇足石杉中HupA含量的时空动态变化

采用线性回归方程分别计算庐山和井冈山蛇足石杉不同时期、不同组织HupA含量，并进行方差分析.结果表明，江西庐山和井冈山蛇足石杉植株中HupA含量均较高，2个样地的含量随着时期的推移有统计学意义上极显著性差异(P﹤0.01)，HupA含量的动态变化规律为12月﹥9月﹥6月﹥3月，且井冈山蛇足石杉植株中HupA含量显著高于庐山植株(见图3).此外，井冈山蛇足石杉在4个时期内HupA含量均有统计学意义上极显著性差异(P﹤0.01)，其中在12月份含量最高;而庐山9月和12月的蛇足石杉植株中HupA含量较高，但2个月份间无统计学意义上显著性差异(P﹥0.05).

图3 不同时期庐山和井冈山蛇足石杉植株HupA含量

研究结果还显示，庐山和井冈山蛇足石杉均为地上部分(茎和叶)中的HupA含量高于地下部分(根)的含量，并且庐山和井冈山蛇足石杉在茎、叶及全株中HupA含量随着季节的推移而呈现出相同的变化趋势，它们的含量均为3月最低，依次分别为178.7、85.7、141.3 μg· g-1与 122.1、105.4、117.7 μg·g-1，而在 12 月达到最大，依次分别为246.0、188.1、211.9 μg· g-1与 369.6、298.9、325.9 μg·g-1(见图4和图5).根中 HupA含量的变化趋势与茎和叶不同，2地蛇足石杉根中HupA含量均在 6月最低，分别仅为 24.5 μg·g-1和17.5 μg·g-1，庐山蛇足石杉根中 HupA含量在3月季最高，达到149.7 μg·g-1(见图 4)，井冈山地区蛇足石杉根中 HupA含量在12月最高，达到97.1 μg·g-1(见图 5).

3 讨论

3.1 HPLC分析方法的改进

本研究中HupA含量的测定方法是在参照马晓强等方法的基础上，经比较和优化多种不同溶剂系统和比例的流动相后，最终确定甲醇-水-三乙醇胺按体积比60.00∶40.00∶0.02为流动相效果最好.采用该流动相，在流速为0.5mL·min-1时HupA主峰能与杂质峰较好分离开，且峰型对称无拖尾，重复性良好，适用少量样品的定量分析检测.

3.2 蛇足石杉中HupA含量的动态变化

图4 庐山蛇足石杉不同时期根(A)、茎(B)、叶(C)中HupA含量

蛇足石杉中HupA的含量极少，在我国已报道的含量中平均值大约仅为 188 μg·g-1［15］，且不同地域的蛇足石杉中HupA含量也存在较大差异(见表3).本研究对江西庐山和井冈山蛇足石杉不同时期、不同组织部位中HupA含量进行了HPLC分析，结果显示，采集自江西庐山和井冈山的蛇足石杉样品中HupA的含量均较高，且均在12月达到最高，分别为 211.9 μg·g-1和 325.9 μg·g-1，可作为高HupA含量优质种源新的潜在资源.本研究发现蛇足石杉植株中HupA的含量动态变化规律为12月﹥9月﹥6月﹥3月，HupA含量随季节更替而有相应的变化(见图3)，这与马晓强等报道的蛇足石杉中HupA含量随时期变化研究结果基本一致，即在10月至12月的含量较高.本研究还发现HupA的含量在植株的地上部分(茎和叶)明显高于地下部分(根)，这与文献［7-8］的研究报道一致.上述的这些研究结果都为勘探筛选高HupA含量的优质蛇足石杉种源奠定了基础，也为科学确定蛇足石杉的最佳采收时机和采集部位提供了参考依据.

图5 井冈山蛇足石杉不同时期根(A)、茎(B)、叶(C)中HupA含量

3.3 HupA含量差异的原因

在比较江西庐山和井冈山蛇足石杉中HupA含量时发现，井冈山植株中HupA含量显著高于庐山植株(P﹤0.01)，这在一定程度上印证了不同地域来源的蛇足石杉植株中HupA含量存在一定的差异性.究其原因，生境条件可能是决定HupA含量高低的主要因素之一［16-17］.采样的庐山蛇足石杉多分布在潮湿树林群落下，而采样的井冈山蛇足石杉多分布在山脚阴面，潮湿灌木下，靠近水源的公路岩石和青苔上，2地的生境条件有较大的差异(见表1).2地环境条件和生态气候类型迥异，以及微环境的差异等因素长期共同自然选择，极有可能导致蛇足石杉中HupA含量存在一定的差异.另外，蛇足石杉植株本身的遗传因素同样不能被忽视.文献［16］对浙江、广西和重庆3个居群的蛇足石杉引种至同一生境后，HupA含量基本与原先未引种时的含量一致，说明HupA含量的高低是遗传因素与环境因素共同作用的结果，因而选育高含量品系植株，同时选择适宜的生境条件对于植株中HupA的累积具有积极的意义.

目前，HupA生产几乎完全依赖野生蛇足石杉资源，价格昂贵，长期开采势必破坏蛇足石杉天然资源和生态环境.因此，拓宽HupA来源和选择新的途径显得尤为重要［18］.倘若能利用微生物发酵生产HupA，不仅能丰富HupA的来源途径、降低药品价格，而且可以有效地保护生态环境.鉴此，本实验室多年来一直致力于产HupA蛇足石杉内生真菌的研究［18-23］，相关的深入研究现正在进行中.

表3 不同产地蛇足石杉中HupA含量

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