孙 涛，李 铭，谢 晶，薛 斌，李 立

（上海海洋大学食品学院，上海水产品加工储藏工程研究中心，上海 201306）

槲皮素与葛根素对食品体系中非酶糖基化的抑制作用

孙 涛，李 铭，谢 晶，薛 斌，李 立

（上海海洋大学食品学院，上海水产品加工储藏工程研究中心，上海 201306）

通过对果糖胺、二羰基化合物、5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF）和荧光性末端产物的检测，考察槲皮素和葛根素对食品体系非酶糖基化反应的抑制作用。结果表明：槲皮素能促进非酶糖基化早期产物果糖胺和5-HMF的生成，对反应中期的二羰基化合物和非酶糖基化末端产物（advanced glycation end products，AGEs）具有较强的抑制作用；葛根素能促进果糖胺的生成，抑制二羰基化合物的生成，对5-HMF和AGEs无影响。这可能与槲皮素与葛根素的结构差异有关。

非酶糖基化；槲皮素；葛根素

非酶糖基化反应，又称美拉德反应，是氨基化合物蛋白质、氨基酸与羰基化合物还原糖之间发生的一系列非酶促反应。非酶糖基化反应使蛋白质发生交联而失去活性，生成不可逆的非酶糖基化末端产物（advanced glycation end products，AGEs）。生成于神经髓鞘的AGEs可促发老年痴呆症[1]；非酶糖基化反应可使体内胶原蛋白交联化，导致动脉粥样硬化[2]；AGEs亦为糖尿病及其并发症的重要产生因素[3-4]。AGEs一般由体内反应生成或日常饮食摄入[5]。食品加工中，还原糖和氨基酸之间会发生复杂的非酶褐变反应，促成某些特有的食品风味和烹饪食品颜色的形成；但另一方面，非酶糖基化反应会产生AGEs。抑制食品体系中非酶糖基化反应反应，从而减少食品体系中AGEs的生成是预防众多疾病的有效途径之一。目前的研究热点是生理条件下抑制非酶糖基化反应，而食品体系中抑制非酶糖基化的研究鲜有报道。

黄酮类化合物是一类重要的天然产物，其母核为2-苯基色原酮，具有清除自由基、抗癌以及防治心血管疾病等功效[6-8]。研究表明，芦丁、槲皮素等黄酮类化合物对于生理条件下非酶糖基化反应有较强的抑制作用[9-11]，但对于黄酮类化合物在食品体系中抑制非酶糖基化反应的研究较少。本实验选取2种常见的黄酮类化合物：槲皮素和葛根素，考察其对果糖-谷氨酸非酶糖基化反应的抑制作用，为抑制非酶糖基化的研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

槲皮素、葛根素 生工生物工程（上海）股份有限公司；氨基胍盐酸盐、5-羟甲基糠醛 梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；Girard-T试剂、氯化硝基四氮唑兰 国药化学试剂有限公司；D-葡萄糖、谷氨酸等其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

DK-S28型恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；UV-2000紫外-可见分光光度计 尤尼科（上海）仪器有限公 司；RF-5301PC荧光分光光度计 日本岛津株式会社；Waters2695高效液相色谱仪 沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 食品体系非酶糖基化反应

配制含0.02 mol/L果糖与0.1 mol/L谷氨酸的pH 5.5、0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液作为食品非酶糖基化体系[12]。分别添加槲皮素与葛根素，使其终浓度为1.0、3.0、5.0 mmol/L，作为非酶糖基化抑制体系。将混合溶液置于沸水浴中冷凝回流反应，分别于3、6、9 h取样并迅速冷却，对果糖胺、二羰基化合物、5-HMF和荧光性末端产物进行检测。设置空白对照组和5.0 mmol/L氨基胍组作阳性对照。

1.3.2 果糖胺的测定

根据Jamnian等[13]的方法加以改动。取0.3 mL样品溶液，添加3.0 mL 0.6 mmol/L NBT试剂和0.7 mL pH 10.35的NaHCO3-Na2CO3缓冲液，然后置于37 ℃水浴10 min，以缓冲液为参比于530 nm波长处测吸光度。按下式计算果糖胺抑制率。

果糖胺抑制率/%=（Ai－Aj）/Ai×100

式中：Ai为非酶糖基化体系的吸光度；Aj为非酶糖基化抑制体系的吸光度。

1.3.3 二羰基化合物的测定

根据Wells等[14]的方法加以改动。取0.5 mL样品溶液，添加0.5 mLGirard-T试剂和7.0 mL pH 2.90的HCOOHHCOONa缓冲液，置于37 ℃水浴1 h后，以缓冲液为参比于295 nm波长处测吸光度。二羰基化合物抑制率计算公式同果糖胺。

1.3.4 5-羟甲基糠醛的测定[15]

采用Waters2695高效液相色谱仪（2998二极管阵列检测器）测定5-羟甲基糠醛（5-HMF）的含量。测试条件如下：色谱柱：C18柱(Altantis T3，4.6 mm×150 mm，4 μm)；流动相：10%甲醇与90%水；流速：1.000 6 dL/min；柱温：25 ℃。

1.3.5 荧光性糖基化产物的测定

取样品溶液于激发波长370 nm、发射波长440 nm测定荧光强度。

1.4 数据处理

所有实验重复3次，取平均值。

2 结果与分析

2.1 槲皮素与葛根素对果糖胺生成的影响

表1 槲皮素与葛根素对果糖胺生成的影响Table 1 Effect of quercetin and puerarin on the formation of fructosaammiinnee

由表1可知，槲皮素以及葛根素对非酶糖基化反应中果糖胺的生成皆有促进作用，反应时间为9 h，加样浓度为5.0 mmol/L时槲皮素与葛根素对果糖胺的促进率分别为50.2%、18.6%；同样，氨基胍对果糖胺的生成也有促进作用。

2.2 槲皮素与葛根素对二羰基化合物生成的影响

表2 槲皮素与葛根素对二羰基化合物生成的影响Table 2 Effect of quercetin and puerarin on the formation of α-dicarbonyl compounds

由表2可知，槲皮素以及葛根素对非酶糖基化反应中二羰基化合物的生成皆有抑制作用，在反应时间为9 h、样品浓度为5.0 mmol/L时，槲皮素与葛根素对二羰基化合物的抑制率分别为23.1%和29.0%；同浓度氨基胍组有更好的抑制效果。

2.3 槲皮素与葛根素对5-HMF生成量的影响

由图1可知，槲皮素对非酶糖基化反应中5-HMF的生成具有促进作用，而葛根素对5-HMF的生成无显著影响。

图1 槲皮素与葛 根素对5-HMF生成的影响Fig.1 Effect of quercetin and puerarin on the formation of 5-HMF

2.4 黄酮类化合物对荧光性非酶糖基化产物的影响

图2 黄酮类化合物对荧光性末端产物生成的影响Fig.2 Effect of quercetin and puerarin on the formation of fluorescent AGEs

由图2可知，葛根素对荧光 性末端产物的生成无影响，而槲皮素对荧光性末端产物的生成则有显著的抑制作用，其抑制效果优于氨基胍。

3 讨 论

本研究使用果糖与谷氨酸模拟食品体系非酶糖基化反应，通过对果糖胺、二羰基化合物、5-羟甲基糠醛和荧光性末端产物的检测，考察了黄酮醇类槲皮素与异黄酮类葛根素对非酶糖基化反应的抑制作用。结果表明，在非酶糖基化反应早期，氨基化合物的氨基和还原糖的羰基发生亲核加成反应，生成非酶糖基化反应的重要检测指标化合物之一果糖胺；同时还原糖还可发生分子内脱水反应降解成糠醛[16]。实验表明槲皮素和葛根素可促进果糖胺的生成。随后果糖胺经过一系列异构化反应形成Amadori产物。在非酶糖基化反应中期，Amadori产物经过氧化、裂解、重排等反应形成乙二醛、乙二酸、丙酮醛、3-脱氧葡萄糖酮醛等二羰基类中间产物[17]。而槲皮素及葛根素对食品体系非酶糖基化反应体系中二羰基化合物表现出较强的抑制作用，这与生理条件下的研究结果相似[18]。此后非酶糖基化反应进入末期，二羰基化合物和糠醛等中间产物与氨基酸进一步交联成不可逆的荧光性末端产物。在本实验中槲皮素对非酶糖基化反应荧光性末端 产物表现出显著的抑制作用，且抑制作用强于氨基胍，此前生理条件下的研究结果也证明了这一点[19]。而葛根素对荧光性末端产物无显著影响。Matsuda等[20]的研究表明，黄酮醇对AGEs的抑制能力强于异黄酮。槲皮素与葛根素分子中芳烃基的取代位置不同可能是导致其非酶糖基化抑制能力差异的原因。

槲皮素能促进非酶糖基化早期产物果糖胺和5-HMF的生成，对反应中期的二羰基化合物和末端荧光性产物（AGEs）具有较强的抑制作用，这表明槲皮素对非酶糖基化反应的抑制作用发生在反应的中后期阶段；葛根素亦能促进果糖胺的生成，但抑制二羰基化合物的生成，对5-HMF和末端荧光性产物无影响。本实验为食品体系非酶糖基化的预防及药物治疗提供了思路，槲皮素和葛根素对于非酶糖基化反应的抑制机理有待进一步研究。

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Inhibitory Effect of Flavonoid Compounds on Dietary Nonenzymatic Glycation

SUN Tao, LI Ming, XIE Jing, XUE Bin, LI Li
(Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-product Processing and Preservation, College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The inhibitory effects of the flavonoid compounds quercetin and puerarin on the formation of fructosamine, α-dicarbonyl compounds, 5-hydroxymethylfurfural (5-HMF) and fl uorescent advanced glycation end products (AGEs) from dietary nonenzymatic glycation were teste d. The results showed that quercetin could promote the formation of fructosamine and an early glycation product (5-HMF) but inhibit the formation of α-d icar bonyl compounds (an intermedate glycation product) and fl uorescent glycation end-products (AGEs). Puerarin could promote the formation of fructosamine, but inhibit the formation of α-dicarbonyl compounds, and had no infl uence on the formation of 5-HMF and fl uorescent AGEs. These results may be related to the different structures of quercetin and puerarin.

nonenzymatic glycation; quercetin; puerarin

TS201.2

A

1002-6630（2014）03-0047-03

10.7506/spkx1002-6630-201403010

2013-04-18

“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD38B04）

孙涛（1970—），女，副教授，博士研究生，研究方向为食品应用化学。E-mail：taosun@shou.edu.cn