金 鑫 赵 艳 喻大军 詹晓东 钱 军＊

（1蚌埠医学院第一附属医院肿瘤外科；2蚌埠医学院第一附属医院临床病理科；3蚌埠医学院第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科，安徽233000）

肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）作为一类数量极少但具有自我更新能力的细胞，在肿瘤研究中日益受到重视。它们具有无限增生的潜能，在肿瘤的发生、发展中起着决定性的作用，并与肿瘤的转移和复发密切相关。人们已经在急性髓细胞白血病、乳腺癌、结直肠癌等［1－3］多种恶性肿瘤中发现肿瘤干细胞，并有分选鉴定出相关肿瘤干细胞标记物的报道。乙醛脱氢酶1（aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1）作为新近发现的肿瘤干细胞标志物，已有在鼻咽癌、肺癌、结直肠癌［4－6］等多种肿瘤中的研究报道。但ALDH1与喉癌的相关性研究在国内尚未开展。本实验通过免疫组化及原位杂交法对我院的喉鳞状细胞癌患者肿瘤及正常组织中的ALDH1进行检测，对其表达与临床病理及预后的关系进行分析。

材料和方法

1．一般资料

收集蚌埠医学院第一附属医院临床病理科2007年6月－2009年1月间喉癌患者的临床病理资料，共计86例。随机选取该组病例中30例切缘组织为正常对照组。蜡块重新切片后由两位病理医师独立复查确认为喉鳞状细胞癌。所有患者术前未行放、化疗。发病年龄55－82岁，中位年龄66岁；所有患者均行根治性手术，其中Ⅰ级15例，Ⅱ级42例，Ⅲ级29例；有淋巴结转移者32例；声门上型42例，声门型33例，声门下11例；术后随访期自入院确诊日期开始至2014年1月31日，失访3例，中位随访期49个月。

2．试剂与方法

2．1试剂

兔抗人ALDH1多克隆抗体购自Abcame公司、ALDH1原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司、免疫组化及原位杂交的其他试剂均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

2．2方法

所有标本均经10%中性福尔马林固定，经常规石蜡包埋，4μm连续切片，（1）免疫组化Elivision法检测ALDH1蛋白的表达：标本脱蜡、水化，微波抗原修复，滴加正常封闭血清，以封闭非特异性抗原。滴加ALDH1一抗（工作浓度1∶100），4℃冰箱过夜，37℃复温45min，PBS液洗3次后，滴加生物素标记的二抗，DAB显色，苏木精复染，分化、返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。（2）原位杂交检测ALDH1mRNA的表达：标本脱蜡、水化，暴露mRNA核酸片断，滴加杂交液，42℃恒温箱反应16－20h，SSC洗涤，滴加封闭液，滴加生物素化鼠抗地高辛，PBS洗3次，滴加生物素化过氧化物酶，37℃，20min，PBS洗涤，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片。所有免疫组化和原位杂交实验均以已知阳性切片作为阳性对照，免疫组化以PBS代替一抗作为阴性对照。

2．3ALDH1蛋白表达检测结果的判定

ALDH1蛋白位于细胞浆，以癌细胞胞浆出现淡黄色至棕褐色颗粒为阳性表达。高倍镜下随机选取5个视野（每个视野观察细胞数不少于200个），按阳性细胞所占百分比及着色深浅进行结果判定：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；＜5%为0分，5%－25%为1分，26%－50%为2分，51%－7 5%为3分，＞75%为4分。以二者乘积分数为最终判定结果：＜3分为阴性（－），3－5分为弱阳性（＋），6－9分为中度阳性（＋＋），10－12分为强阳性（＋＋＋），（＋）－（＋＋＋）均视为阳性病例。最终得分＜6分为低表达，≥6分为高表达。

2．4ALDH1mRNA表达检测结果的判定

以细胞浆出现淡黄色至棕褐色颗粒为阳性表达。染色强度判断标准参照免疫组化判定标准。

2．5统计学方法

采用SPSS13．0软件进行统计处理，采用χ2检验或Fisher精确检验，生存分析采用Kaplan－Meier法，log－rank检验比较生存差异，采用COX比例风险模型分析预后因素。以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．ALDH1蛋白表达及其与临床病理特征的关系

ALDH1染色定位于细胞质中，呈棕黄色颗粒（图1，2）。ALDH1在癌组织中表达高于正常组织（P＜0．05）（表1），在86例喉鳞癌组织中，ALDH1低表达61例，高表达25例；30例正常喉组织均为低表达（图3）。32例淋巴结阳性患者中ALDH1高表达15例，低表达17例，54例淋巴结阴性患者中，ALDH1高表达10例，低表达44例，ALDH1在淋巴结阳性和阴性组之间表达有统计学差异（P＜0．05）。此外ALDH1的表达与患者年龄、有无吸烟史、喉癌的部位、浸润范围、临床分期无明显相关性（P＞0．05）；与有无淋巴结转移相关（表2）。

2．不同组织中ALDH1mRNA的表达

喉鳞癌组织中ALDH1mRNA的表达和蛋白的表达基本一致（图4，表1），即随着喉癌细胞胞浆内ALDH1mRNA转录水平的增高，喉癌组织中ALDH1蛋白表达水平也增加。

3．ALDH1表达与喉癌患者预后关系

83例患者接受了随访。ALDH1蛋白高表达患者的无病生存期为（37．02±5．31）个月，5年无病生存率为32%；ALDH1蛋白低表达患者的无病生存期为（57．58±2．13）个月，5年无病生存率67%；ALDH1蛋白高表达患者的无病生存率明显低于低表达患者，差异有统计学意义（P＜0．05）（图5）。

图1 ALDH1在高分化喉癌组织中的表达（高表达）免疫组化Elivision法 ×400图2 ALDH1在低分化喉癌组织中的表达（高表达）免疫组化Elivision法 ×400图3 ALDH1在对照组织中的表达（低表达）免疫组化Elivision法 ×400图4 ALDH1mRNA在喉癌组织中的表达（高表达）原位杂交 ×400图5 喉癌组织ALDH1表达与预后关系Fig．1The expression of ALDH1in high differentiation of laryngeal cancer tissues（Elivision ×400）Fig．2The expression of ALDH1in low differentiation of laryngeal cancer tissues（Elivision×400）Fig．3The expression of ALDH1in normal tissues（Elivision×400）Fig．4ALDH1mRNA high expression in laryngeal cancer tissues（DAB ×400）Fig．5Survival curves of patients with positive and negative ALDH1expression

表1 喉癌及正常组织中ALDH1蛋白和mRNA的表达（例）Table 1 ALDH1protein and mRNA expression in different laryngeal cancer tissues

表2 ALDH1表达与临床病理特征之间的关系Table 2 The relationship between ALDH1protein expression and clinicopathological characteristics

讨 论

喉癌是常见的头颈部肿瘤，占耳鼻咽喉恶性肿瘤的7．9%－35% ，其发病率目前有明显增长的趋势［7］。随着喉外科治疗技术逐步成熟，喉癌的治疗取得了巨大进步，肿瘤患者的5年生存率已大大提高，但仍存在肿瘤复发、转移，对放疗不敏感等问题。随着肿瘤干细胞基础研究的不断展开，人们在多种肿瘤组织中发现了肿瘤干细胞的存在，它作为一类数量极少但具有自我更新能力的肿瘤细胞在肿瘤的发生、发展中起决定性作用。从肿瘤干细胞的角度进行研究为临床提高治疗效果，减少复发提供新的思路和切入点。肿瘤干细胞研究的首要问题就是分离鉴定。但是由于缺乏特异的表面标记，分离纯化一直是长久以来各国学者亟待解决的难题之一。目前对于干细胞的分离鉴定多集中在干细胞的分选和特异性分子标记物的研究两个方面。

乙醛脱氢酶1（aldehyde dehydrogenase，ALDH1）是乙醛脱氢酶家族成员之一，是催化细胞内乙醛氧化为乙酸的细胞溶质酶，参与多种组织的分化与基因表达。ALDH1蛋白表达于细胞质内，基因位于9号染色体，有13个外显子，由53×103个碱基对构成，编码501个氨基酸残基［8］。自2007年，Ginestier等［9］首次报道利用ALDH1在乳腺癌实体组织中发现了乳腺癌干细胞后，ALDH1作为新发现的肿瘤干细胞标志物先后被证实为鼻咽癌、肺癌、胰腺癌、结直肠癌干细胞的通用标记物［3－6，10］，同时 ALDH1与患者临床治疗及预后的相关性研究亦逐步展开，Ginestier发现ALDH1高表达患者的预后明显低于ALDH1低表达患者，在头颈部肿瘤方面Chen YC等［11］研究也发现，在头颈部鳞癌（鼻咽癌为主）的治疗过程中ALDH1高表达患者显示出明显的治疗耐受，而低表达患者在受到相同治疗时，表现出较好的治疗效果，且预后优于ALDH1高表达患者。

本研究组在前期实验中，应用荧光细胞化学染色及流式细胞术观察和检测喉癌Hep－2细胞系中的ALDH1的表达；应用流式分选术分离ALDH1br亚群细胞，观察ALDH1不同亚群细胞增殖能力及体外分化能力。得出在喉癌Hep－2细胞系中，ALDH1br亚群细胞具有强的体外分化和增殖能力，ALDH1可以作为喉癌Hep－2细胞系的肿瘤干细胞标志物之一的结论［12］。

本次实验发现，ALDH1在喉鳞状细胞癌组织中有不同程度的表达，其中高表达者占29．1%（25／86），占较少部分；在淋巴结阳性组中的ALDH1高表达率（46．9%）较淋巴结阴性组高表达率（18．5%）明显增高；在喉鳞状细胞癌实体肿瘤中，ALDH1有不同程度的表达，其中高表达患者比例较少，这与在细胞系中ALDH1的表达情况相似。同时我们还发现ALDH1的表达与患者年龄、有无吸烟史、喉癌的部位、浸润范围、临床分期无明显相关性，与有无淋巴结转移密切相关。5年生存率分析结果亦显示ALDH1高表达组明显低于低表达组，提示ALDH1含量越高，其预后越差。

总之，通过检测ALDH1在喉鳞癌组织中的表达，结合本研究组前期的细胞学实验，可以认为ALDH1能作为喉鳞癌组织肿瘤干细胞的标志物，在喉鳞癌的预后判断中有重要价值，且有望成为喉癌干细胞研究和靶向治疗的新方向。

［1］Hosen N，Park CY，Tatsumi N，et al．CD96is a leukemicstem cell－specific marker in human acute myeloid leukemia．PNAS，2007，104（26）：11008－11013

［2］Al－Hajj M，Wicha M S，Benito－Hernandez A，et al．Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells．PNAS，2003，100（7）：3983－3988

［3］Ignatova TN，Kukekov VG，Laywell ED，et al．Human cortical glial tumors contain neural stem－like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro．Glia，2002，39（3）：193－206

［4］Seigel GM，Campbell LM，Narayan M，et al．Cancer stem cell characteristics in retinoblastoma．Mol Vis．2009，11：729－37

［5］Dylla SJ，Beviglia L，Park IK，et al．Colorectal cancer stem cells are enriched in xenogeneic tumors following chemotherapy．PLoS One．2008，3（6）：e2428

［6］Huang EH，Hynes MJ，Zhang T，et al．Aldehyde dehydrogenase 1is a marker for normal and malignant human colonic stem cells （SC）and tracks SC overpopulation during colon tumorigenesis．Cancer Res，2010，69（8）：3382－3389

［7］田勇泉，孙爱华．耳鼻咽喉－头颈外科学．北京：人民卫生出版社，2004．216

［8］Triel C，Vestergaard ME，Bolund L，et al．Side population cells in human and mouse epidermis lack stem cell characteristics．Exp Cell Res，2004，295：79－90

［9］Ginestier C，Hur MH，Charafe－Jauffret E，et al．ALDH1is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome．．Cell Stem Cell，2007，1（5）：555－567

［10］Pearce DJ，Taussig D，Simpson C，et al．Characterization of cells with a high aldehyde dehydrogenase activity from cord blood and acute myeloid leukemia samples．Stem Cells，2011，23（6）：752－60

［11］Chen YC，Chen YW，Hsu HS，et al．Aldehyde dehydrogenase 1is a putative marker for cancer stem cells in head and neck squamous cancer．Biochem Biophys Res Commun，2009，385（3）：307－313

［12］金鑫，赵艳，唐洁等．ALDH1作为喉癌 HEP－2细胞系肿瘤干细胞标志物的实验研究．中华肿瘤杂志，2011，33（12）：900－904