刘海龙，黎妍妍,，严亚琴，郑 露，李锡宏，黄俊斌*

（1.华中农业大学植物科技学院，湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室，武汉 430070；2.湖北省烟草科学研究院，武汉 430030）

烟草青枯病是烟草上发生最重要的土传病害之一，由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）侵染引起，其寄主范围包括54个科的450余种植物[1]。1864年在印尼首先报道了青枯菌对烟草的毁灭性危害。此后，该病逐渐成为美国、日本、澳大利亚、韩国等许多产烟国家烟草重要的细菌病害[2-3]。烟草青枯病在我国主要产烟区普遍发生，其中以广东、广西、福建、湖南及贵州烟区危害最为严重[4]。近年来，由于气候变化等原因，该病的发生范围在我国有由南向北蔓延之势[5]。

培育和推广抗病品种是防治烟草青枯病最有效的措施，但由于不同地理起源或寄主来源的青枯菌具有明显的生理分化现象[6]，极易导致筛选的抗病品种丧失抗病性。因此，进行烟草青枯菌的生理分化研究对选育和推广抗病品种具有重要作用。

目前，国际上公认的青枯菌亚分类系统有：一是根据青枯菌侵染的寄主范围和对3种双糖和3种己醇的利用能力分别将其划分为5个生理小种（r1，2，3，4，5）和6个生化型（bvⅠ，Ⅱ，ⅡT，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ）[7-10]；二是由Fegan和Prior等提出的将青枯菌划分为 4个演化型（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ），每个演化型又可进一步划分为一系列的序列变种（sequevar）[11-12]。迄今为止，国内外已有较多关于烟草青枯病菌生理分化的研究报道；美国、韩国等国家已对本地区的烟草青枯菌菌系分化情况进行了深入研究[13-14]；我国部分地区如山东、江西、四川、湖南、安徽等也已开展了烟草青枯菌的生理小种和生化型鉴定研究[15-19]；参照新的青枯菌划分体系并对福建、广西、贵州等地的烟草青枯菌演化型进行了鉴定[20-21]。而在湖北省未见烟草青枯病菌生理小种、生化型或演化型的相关报道。恩施地区作为湖北省最大的产烟区，其烟草青枯病的发生日趋严重；因此，有必要对该烟区的烟草青枯菌生理小种、生化型及演化型进行鉴定。

本研究参照传统的生理小种和生化型鉴定方法，结合国际最新的青枯菌演化型分类体系，旨在初步探究湖北省恩施烟区烟草青枯病菌的生理分化情况，为湖北省烟草青枯病的防控及烟草的抗病育种工作提供必要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株分离、鉴定

2013年6—9月分别于湖北省恩施州的宣恩、咸丰、利川等8个县（市）烟田采集烟草青枯病病株样品64份。采用稀释划线分离法[22]，在TTC培养基上进行划线，观察分离结果。挑取疑似青枯菌野生型菌落转接于NA平板，30 ℃条件下培养48 h后，挑菌于无菌水中 20 ℃下保存备用。采用已报道青枯菌种的特异性引物759F⁄760R对分离菌株进行分子鉴定[10]，根据扩增条带大小进一步确定分离菌株是否为青枯菌。

1.2 生理小种测定

采用注茎接种法[18]，将供试菌株（浓度为108cfu/mL）分别接种青枯菌鉴别寄主烟草、番茄、茄子、马铃薯、花生和辣椒，每个菌株每种寄主接种2株，设立3次重复，每种寄主植物取6株接种无菌水作为对照，接种后置于温度 30 ℃，湿度大于80%的温室诱导发病，接种2 d后开始检查发病情况，10 d后统计发病结果。根据供试菌株接种寄主的抗感反应确定生理小种归属。

1.3 生化型鉴定

参照Hayward的方法[10]，分别将3种双糖（乳糖、麦芽糖和纤维二糖）和3种己醇（甘露醇、山梨醇和甜醇）配成10%的溶液，灭菌（3种双糖用过滤法灭菌，3种己醇经121 ℃蒸气灭菌）后分别加入基本培养基中，使其终浓度为 1%。而后将供试菌株分别移至含不同碳水化合物的测定培养基上，在30 ℃的恒温培养箱中培养21 d。根据供试菌株对3种双糖和3种己醇的利用情况，即培养基的颜色变化，确定各菌株的生化型分类归属。

1.4 演化型鉴定

选用 MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction试剂盒（ver2.0，大连宝生物工程有限公司）提取供试菌株基因组DNA。PCR扩增采用25μL反应体系，其中包括10×PCR buffer，Taq酶2U，MgCl21.5 mM，dNTPs 200 µM，引物759F和760R各 4 pmol，引物 Nmult21:1F，Nmult21:2F，Nmult23:AF，Nmult22:InF，Nmult22:RR（由武汉擎科创新生物科技有限公司合成，表1）各6 pmol，DNA模板50 ng，ddH2O补足25 μL。反应程序为96 ℃，5 min；94 ℃，15 s；59 ℃，30 s和72 ℃，30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR产物于1.8%的琼脂糖凝胶中电泳，通过Biorad凝胶成像仪观察结果。根据PCR扩增片段大小确定供试青枯菌菌株的演化型。

2 结 果

2.1 青枯菌菌株分离、鉴定

2013年6—9月在湖北恩施地区8个县（市）上采集病株，通过TTC培养基分离得到54个青枯菌野生型（菌落较大，稍凸起，不规则圆形，中央粉红色，边缘乳白色，白边较宽）菌株，通过青枯菌种特异性引物进行扩增，结果表明，54个菌株均能扩增得到大小为280 bp的条带（图1）进一步确定54个菌株均为青枯菌。分离菌株编号见表2。

2.2 生理小种鉴定结果

通过供试菌株接种青枯菌生理小种鉴别寄主后的抗感反应，来确定其生理小种的归属。对6种寄主植物注茎接种2~3 d后的结果表明，54个烟草青枯菌菌株对6种鉴别寄主均有致病作用，发病率为 100%，症状表现为注射区初有褪绿斑，逐渐变的3个主栽烟草品种云烟87、毕纳1号和鄂烟1号黑褐色，而后向四周扩展，引起叶片萎蔫，最终整个植株枯萎死亡；因此，根据侵染的植物种类范围，可将所有供试菌株划分为生理小种1号。

2.3 生化型鉴定结果

根据青枯菌对3种双糖和3种己醇的利用情况来确定供试菌株的生化型。鉴定结果表明，各菌株接种不同培养基后，培养基初为蓝绿色，在细菌生长过程中培养基逐渐变为黄色，这表明细菌氧化利用了培养基中糖或醇并产酸，pH下降，使培养基中的溴百里酚蓝在酸性条件下变色。54个供试菌株均能利用3种双糖和3种己醇，依据青枯菌生化型划分标准，将其划分为生化型Ⅲ。

图1 多重PCR鉴定烟草青枯菌演化型Fig.1 The phylotypes of Ralstonia solanacearum identified by multiplex-PCR

表2 烟草青枯菌菌株来源Table 2 Original source of Ralstonia solanacearum strains

2.4 演化型鉴定结果

根据最新的青枯菌演化型分类体系，采用PCR检测体系对 54个供试菌株的基因组 DNA进行扩增。结果表明，54个菌株均可同时扩增到片段大小分别为280 bp和144 bp的2条特异性片段（表2、图1）。其中大小为280 bp的片段为青枯菌特异性扩增条带；144 bp的片段为演化型Ⅰ的特异性扩增条带。由此可知，供试的 54个青枯菌菌株均属于演化型Ⅰ。

3 讨 论

作为传统的青枯菌菌系划分标准，生理小种和生化型的划分存在一定的局限性，即不能有效地反应出病原菌在进化及地理起源上的差异[11]。随着分子生物学的发展，Fegan等[11]提出了1个新的分类体系，将青枯菌分为4个不同的演化型，用于描述青枯菌种以下的差异。美国、韩国等国已进行了烟草青枯菌的生理分化研究，报道的全部生理小种测定结果为生理小种1号，而生化型和演化型的结果则不完全相同。其中美国报道的烟草青枯菌属于生化型Ⅰ，演化型Ⅱ[13]；韩国的烟草青枯菌属于生化型Ⅲ和Ⅳ，演化型Ⅰ[14]。在我国山东、江西、四川、湖南、安徽等地区已报道的青枯菌生理小种和生化型鉴定结果中，烟草青枯菌属于生理小种1号，生化型存在Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ4个型，其中大部分菌株属于生化型Ⅲ和Ⅴ[15-19]。对福建、贵州、广西、广东等地的烟草青枯菌演化型进行了鉴定，鉴定结果显示这些省份的烟草青枯菌属于演化型Ⅰ型[12,20-21]。

4 结 论

本研究从湖北省恩施州宣恩、咸丰、利川和巴东等主要产烟县（市）的感病烟株上分离得到 54个青枯菌菌株，对其生理小种、生化型和演化型进行鉴定，将所有菌株均划分为生理小种1号，生化型Ⅲ和演化型Ⅰ。从研究结果来看，湖北恩施地区烟草青枯菌群体结构较为单一，生理分化现象不明显，这对该地区筛选和利用烟草青枯病抗病品种是一个较为有利的条件，在烟草抗青枯病育种过程中，可以适当的培育和引进一些针对生化型Ⅲ和演化型Ⅰ菌株选育出的新的烟草抗病品种；尽管如此，青枯菌群体具有极强的适应性，随着栽培品种的不断更替，青枯菌会不断发生生理分化，表现不同的生化型。而根据演化型分类框架，每个演化型还可进一步划分为多个序列变种。因此，我们今后还需要分离更多烟草青枯菌，并对青枯菌序列变种水平或更详细分类水平的差异进行分析，为培育和筛选抗病烟草品种提供理论依据。

[1]Wicker E, Grassart L, Coranson B R, et al.Ralstonia solanacearum strains from Martinique (French West Indies) exhibiting a new pathogenic potential[J].Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(21):6790-6801.

[2]Hayward A C.Biology and epidemiology of bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum [J].Annual Review of Phytopathology, 1991, 29(1): 65-87.

[3]周训军，王静，杨玉文，等.烟草青枯菌研究进展[J].微生物学通报，2012，39（10）：1479-1486.

[4]陈瑞泰，朱贤朝，王智发，等.全国16个生产烟省（区）烟草侵染性病害调研报告[J].中国烟草科学，1997，18（4）：1-7.

[5]孔凡玉.烟草青枯病的综合防治[J].烟草科技，2003（4）：42-48.

[6]Gillings M R, Fahy P.Genomic finger rinting: towards a unified view of the Pseudomonas solanacearum species complex[M].UK：CAB International, 1994: 95-112.

[7]Buddenhagen I, Sequeira L, Kelman A.Designation of races in Pseudomonas solanacearum [J].Phytopathology，1962, 52: 726.

[8]He L Y, Sequeira L, Kelman A.Characteristics of strains of Pseudomonas solanacearum[J].Plant disease, 1983,67(12): 1357-1361.

[9]Pegg K G, Moffett M.Host range of the ginger strain of Pseudomonas solanacearum in queensland[J].Australian Journal of Experimental Agriculture and Animal Husbandry, 1971, 11: 696-698.

[10]Hayward A C.Characteristics of Pseudomonas solanacearum[J].Journal of Applied Bacteriology, 1964,27: 265-277.

[11]Fegan M, Prior P.How complex is the “Ralstonia solanacearum species complex” [M].St.Paul: APS, 2005:449-462.

[12]Xu J, Pan Z C, Prior P.et al.Genetiac Diversity of Ralstonia solanacearum strains from China[J].European Journal of Plant Pathology, 2009, 125: 641-653.

[13]Hong J C, Norman D J, Reed D L.et al.Diversity among Ralstonia solanacearum strains isolated from the southeastern United States[J].Phytopathology, 2012, 102:924-936.

[14]Yi Y K, Kim J H, kang S K, et al.Classification of Pseudomonsa solanacearumisolates from tobacco plants in Korea[J].Korean Journal of Plant Protection, 1982,21(3): 123-127.

[15]郑继发，丁爱云，张建华，等.山东省烟草青枯病的发生和病原菌鉴定研究[J].山东农业大学学报，1996，27（1）：17-22.

[16]周泽科，张超群，蒋军喜，等.江西省烟草青枯菌生理小种及生化型鉴定[J].江西农业大学学报，2013，35（4）：738-742.

[17]刘旭，夏先全，姚革，等.四川省烟草青枯病的病原菌及发病规律研究[J].西南农业学报，2008，21（6）：1587-1590.

[18]邓正平，匡传富，周志成，等.湖南烟草青枯病菌生理小种测定[J].湖南农业大学学报，2004，30（1）：47-49.

[19]顾江涛，许大凤，李英，等.安徽皖南烟区烟草青枯病病原菌生化型研究[J].中国烟草科学，2008，29（3）：60-61.

[20]徐进，顾刚，潘哲超，等.福建烟草青枯菌演化型及生化变种鉴定研究[J].中国烟草学报，2010，16（6）：66-71.

[21]潘哲超，徐进，顾刚，等.福建及贵州等地烟草青枯菌系统发育分析[J].植物保护，2012，38（1）：18-23.

[22]邹阳，肖崇刚，易龙，等.重庆地区烟草青枯病菌的生物型测定[J].烟草科技，2007（6）：62-64.