李成，禹洋，徐佳，刘畅，周兴东，李晓云

（1.东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030；2.东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030）

旋毛虫重组HSP70对小鼠巨噬细胞TLR2/4表达的影响

李成1，禹洋2，徐佳2，刘畅2，周兴东2，李晓云2

（1.东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030；2.东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030）

观察旋毛虫重组热休克蛋白HSP70（rTs-HSP70）对体外培养小鼠巨噬细胞Toll样受体TLR2/4表达的影响。体外常规培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7，分别加入不同浓度rTs-HSP70刺激培养24 h，半定量PCR方法检测培养细胞TLR2/4 mRNA表达，流式细胞仪检测表面标志分子CD80和CD86表达。平行设立不加刺激物阴性对照组，细菌脂多糖LPS阳性对照组；同时试验比较5 μg·mL-1浓度的HSP70组和HSP70+LPS组（HSP70预刺激后再加入LPS刺激培养12 h）RAW264.7细胞TLR2/4 mRNA表达差异。结果表明，低浓度rTs-HSP70与巨噬细胞活化呈正相关，浓度为5 μg·mL-1时，TLR2/4表达水平达到峰值（P＜0.05），并可刺激巨噬细胞共刺激分子CD80和CD86高表达，随着HSP70浓度升高（＞5 μg·mL-1）则对巨噬细胞RAW264.7表现为抑制作用；当对RAW264.7进行旋毛虫HSP70预刺激，可引起免疫抑制效应，抑制LPS对巨噬细胞TLR2/4的活化反应。试验可为旋毛虫相关分子免疫调节机制研究及旋毛虫病防治提供参考。

旋毛虫重组HSP70；巨噬细胞RAW264.7；TLR2；TLR4

旋毛虫病（Trichinellosis）是一种危害严重的人兽共患寄生虫病，被卫生部列为“十一五”期间重点攻克主要食源性寄生虫病之一，宿主因生食或半生食含有旋毛虫肌幼虫（Muscle larva）肉类而感染[1]。该病临床症状复杂多样，诊断较困难，研制疫苗是免疫防治该病的有效措施。热休克蛋白（HSPs）是细胞在应激条件下产生的一类具有高度保守性蛋白质，广泛存在于各种原核和真核细胞中，其中HSP70（相对分子质量70 ku）是所有生物中最保守的热休克蛋白，也是大多数抗原感染中的免疫显性抗原[2]。在前期研究中，根据GenBank中已发表旋毛虫HSP70基因序列设计一对引物，应用Trizol法从旋毛虫肌幼虫提取总RNA，利用RT-PCR方法扩增旋毛虫HSP70基因，对全长CDS区进行克隆及原核表达，经免疫印迹分析与免疫组织化学染色并免疫Balb/c小鼠，证明表达纯化的HSP70具有良好的免疫原性[3]。

Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）作为免疫细胞表面主要受体，能够识别不同类型病原体相关分子模式（PAMPs，也称为Toll样受体的配体或激动剂），并快速激活相关信号通路，引起免疫应答及炎性因子释放，对宿主的天然免疫防御具有重要作用[4]。目前在人类和小鼠体内分别发现11和13种TLRs，其中TLR2/4作为单核-巨噬细胞表面两种重要的TLRs，能分别结合G+和G-菌相应成分，TLRs亦能识别细胞死亡后释放的HSP60，其与巨噬细胞表面TLR4结合，从而介导相应促炎性介质TNF-α和NO的分泌[5]。此外，TLRs在寄生虫感染宿主后天然免疫中起关键作用，如曼氏血吸虫虫卵可通过激活小鼠髓样树突状细胞上的TLR2促使转录因子、细胞因子（如TNF-α、IL-12 p40和IFN-β）转录表达[6]；曼氏血吸虫的可溶性制备物可通过刺激巨噬细胞表面受体TLR4，产生炎性细胞因子[7]；TLR2在旋毛虫重组HSP70刺激未分化DCs分化过程中起到重要作用[8]。旋毛虫重组HSP70（rTs-HSP70）是否通过TLRs途径介导小鼠巨噬细胞活化尚不清楚，为此本文针对目前研究较多的TLR2/4，应用半定量PCR方法和流式细胞术，观察rTs-HSP70对体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7 TLR2/4受体及共刺激分子CD80和CD86表达的影响，为旋毛虫病诊断防治及其致病机理、免疫调节机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞株与重组蛋白

小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞，购自中国科学院；旋毛虫重组HSP70，由东北农业大学动物医学学院寄生虫实验室克隆表达。

1.2 主要试剂与仪器

优级胎牛血清、100 000 IU·mL-1青霉素/链霉素（购自天津灏洋生物公司）；DMEM培养基（购自美国HyClone公司）；LPS、胰酶1∶250（购自美国Sigma公司）；DNA Marker、M-MLV反转录酶、Random primer、限制性内切酶、RNA酶抑制剂，均购自大连宝生物工程有限公司；Anti-Mouse CD80 FITC、Anti-Mouse CD86 PE（购自美国eBioscience公司）；倒置显微镜：Nikon公司产品；CO2恒温培养箱：Q/TEUC8-2002型，HelForce发展科技有限公司；PCR仪（美国Thermo公司）；流式细胞仪：BD FACScalibur型（美国Becton Dickinson公司）。

1.3 不同浓度rTs-HSP70对RAW264.7细胞活化作用

1.3.1 细胞培养和分组

将小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞接种于100 mL·L-1胎牛血清、100 U·mL-1青霉素/链霉素DMEM培养液中贴壁培养，置37℃、50 mL·L-1CO2培养箱中，倒置显微镜观察巨噬细胞形态，采用胰蛋白酶-EDTA消化液进行细胞传代，每2 d传代1次。

将RAW264.7细胞以每孔5×105接种于12孔板培养2 h后，细胞分为阴性对照组（加入等量培养液）、rTs-HSP70刺激组（浓度分别为2、5、10、15 μg·mL-1）、阳性对照组（加入LPS 100 ng·mL-1作用12 h），24 h后终止培养，弃去培养液，以PBS洗涤收集细胞，进行相应检测。

1.3.2 RAW264.7细胞TLR2/4 mRNA相对表达量检测

应用半定量PCR法检测TLR表达量。首先Trizol法提取总RNA，反转录合成cDNA，然后以其为模板分别扩增TLR2、TLR4和内参β-actin特异序列片段。PCR产物以10 g·L-1琼脂糖凝胶电泳鉴定，Quantity one软件分析PCR产物电泳条带密度，目的产物相对量=目的产物电泳条带密度/ β-actin产物电泳条带密度×100%。

1.3.3 AW264.7细胞表面标志分子CD80和CD86检测

应用流式细胞术检测细胞表面共刺激分子CD80和CD86表达水平。用PBS漂洗细胞后轻弹悬起细胞，计数并调整细胞浓度为5×105个mL-1，每份样品分装2管，对照管和待检管，向待检管加入2 μL Anti-Mouse CD80 FITC和1.5 μL Anti-Mouse CD86 PE，充分混匀，4℃避光孵育1 h，PBS离心洗涤2次，上流式细胞仪进行检测。

1.4 rTs-HSP70对RAW264.7细胞TLR2/4 mRNA抑制作用

RAW264.7巨噬细胞培养同1.3。根据实验目的设空白对照组、阳性对照组和试验组，各设3个复孔。试验组分为两组，rTs-HSP70组和rTs-HSP70+ LPS组。空白对照组（加等量培养基）、阳性对照组（加入LPS，100 ng·mL-1，作用12 h）、rTs-HSP70组（加入rTs-HSP70，终浓度5 μg·mL-1）和rTs-HSP70+LPS组（先加入rTs-HSP70（5 μg·mL-1），作用24 h后，再加LPS（100 ng·mL-1）作用12 h）。培养24 h后结束反应，收集细胞，提取总RNA进行半定量PCR检测，方法同1.4，测定TLR2/4 mRNA相对表达量。

1.5 试验数据统计分析

应用SPSS17.0软件进行处理，试验数据用±s表示，采用t检验进行统计学分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 rTs-HSP70诱导RAW264.7细胞TLR2/4 mRNA表达检测

应用特异性引物对不同浓度的rTs-HSP70刺激培养后小鼠巨噬细胞RAW264.7 TLR2、TLR4和β-actin基因进行PCR克隆与鉴定，均扩增出相应目的片段，大小与预期一致。结果如图1。

图1 不同浓度rTs-HSP70诱导RAW264.7细胞TLR2/4 mRNA相对表达量Fig.1 TLR2/4 mRNA relative expression of RAW264.7 cell stimulated by different rTs-HSP70 concentration

由图1可知，不同浓度rTs-HSP70诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞24 h后，TLR2和TLR 4 mRNA相对表达量变化相似，与rTs-HSP70呈现出一定量效关系。空白对照组有少量TLR2/4 mRNA表达；以2 μg·mL-1HSP70刺激时TLR2/4 mRNA与空白对照组比较无统计学意义（P＞0.05）；随着rTs-HSP70浓度的增加，TLR2/4表达水平与空白对照组相比显著上升；当rTs-HSP70浓度为5 μg·mL-1时，TLR2/4表达水平达到峰值，与对照组相比差异显著（P＜0.05）；当rTs-HSP70浓度增加到10～15 μg·mL-1时，TLR2/4 mRNA表达出现下降趋势；5和15 μg·mL-1浓度时组间比较，TLR2 mRNA表达存在显著性差异（P＜0.05）。

2.2 RAW264.7细胞表面标志分子CD80和CD86检测

CD80和CD86分子以单体形式表达于抗原呈递细胞表面，是免疫细胞活化重要的第二信号。在正常生理情况下，巨噬细胞表面几乎没有CD80和CD86分子表达，当巨噬细胞受到革兰氏阴性菌胞壁中脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）等抗原刺激时，抗原呈递细胞表面共刺激分子CD80和CD86表达明显增加，从而发挥其共刺激作用。

图2 FACS检测不同浓度rTs-HSP70刺激RAW264.7细胞CD80/CD86分子的表达Fig.2 CD80/CD86 expression in RAW264.7 cell stimulated by different rTs-HSP70 dosages using FACS

应用免疫荧光抗体双标记方法，通过流式细胞仪检测不同浓度rTs-HSP70共孵育后的RAW264.7细胞表面CD80和CD86分子表达情况，试验结果见图2、3。各待检组细胞总数约为5×105个，其中75%以上是活细胞，低剂量rTs-HSP70（浓度＜5 μg·mL-1）刺激组较空白对照组RAW264.7细胞CD80和CD86分子表达阳性率增加，且CD80和CD86分子表达情况与rTs-HSP70作用浓度呈正相关；当rTs-HSP70作用浓度为5 μg·mL-1时，RAW264.7细胞CD80+、CD86+细胞分别是14.0%和5.4%；在rTs-HSP70浓度＞5 μg·mL-1时，随刺激物rTs-HSP70浓度的增加，RAW264.7细胞中CD80+细胞比例降低，CD86+细胞在总RAW264.7细胞中比例趋于平缓。由此表明，低浓度rTs-HSP70对巨噬细胞CD80和CD86分子表达有促进作用，随着rTs-HSP70作用浓度的增加，刺激物对巨噬细胞共刺激分子CD80和CD86表达表现为抑制作用。

图3 不同浓度rTs-HSP70刺激RAW264.7细胞CD80/CD86分子表达的动态变化Fig.3 CD80/CD86 changes in RAW264.7 cell stimulated by different rTs-HSP70 dosages

2.3 HSP70对RAW264.7细胞TLR2/4 mRNA表达抑制作用

图4 rTs-HSP70对RAW264.7细胞TLR2/4 mRNA表达影响Fig.2 CD80/CD86 expression in RAW264.7 cell stimulated by different rTs-HSP70 dosages using FACS

将HSP70预处理RAW264.7细胞再进行LPS刺激，与单独LPS刺激的巨噬细胞组相比，观察HSP70对LPS刺激的巨噬细胞TLR2/4表达作用。将rTs-HSP70单独刺激组、rTs-HSP70预刺激后LPS再诱导组以及空白对照组、阳性对照组小鼠巨噬细胞RAW264.7中TLR2/4基因进行PCR扩增，实验组和对照组均扩增出目的基因，与实验设计基因片段大小一致。试验结果（见图4）显示：空白对照组和各实验组中均有TLR2/4的表达，5 μg· mL-1的rTs-HSP70作用巨噬细胞24 h后，TLR2/4 mRNA表达均有升高；5 μg·mL-1的rTs-HSP70预处理24 h的RAW264.7细胞，LPS再次诱导TLR2/4 mRNA表达与LPS单独刺激比较明显受到抑制，却存在显著性差异（P＜0.05）；rTs-HSP70预处理组与rTs-HSP70单独刺激组间TLR2/4 mRNA表达的差异不显著无统计学意义（P＞0.05）。实验结果表明，HSP70通过降低巨噬细胞表面受体TLR2/4表达抑制LPS介导的细胞信号传导。

3 讨论与结论

旋毛虫ES抗原在旋毛虫病免疫诊断、免疫病理及免疫防御方面早已有研究[9]，但是关于旋毛虫HSP70对免疫细胞作用研究鲜有报道。HSP70家族具有高度保守性，分布广泛，在真核和原核细胞中均有表达[10]。除存在于细胞或组织内，旋毛虫排泄分泌抗原（ES抗原）中也可检测到HSP70[3,11]。正常情况下少量表达，而在应激情况下表达量增加。寄生虫HSP70属于高度保守分子，在机体免疫应答及免疫调节中起重要作用[12-13]。王少华等研究证明旋毛虫重组HSP70可诱导未成熟的DC成熟而最终达到活化，从而加强宿主抵抗旋毛虫感染能力[8]。 Aosai等研究发现刚地弓形虫HSP70对TLR2和MyD88基因敲除的小鼠体外分离培养的树突状细胞，通过激活DC表面TLR4使DC成熟活化[14]。

本试验应用小鼠巨噬细胞系RAW264.7作为模型，以旋毛虫重组HSP70为刺激物对体外培养的巨噬细胞RAW264.7活化作用进行初步研究。TLRs在细胞活化信号转导中起重要作用，当蠕虫入侵机体时可通过TLR感应，调节TLR的表达与功能，从而达到适度的免疫状态。TLR2和TLR4是巨噬细胞表面存在的能够与寄生虫HSP70结合的主要表面受体[15]，本试验结果表明HSP70刺激RAW264.7细胞后，在一定作用剂量范围内可使细胞表面受体TLR2/4 mRNA表达升高，存在一定剂量依赖性，即低浓度rTs-HSP70与巨噬细胞活化呈正相关，在rTs-HSP70为5 μg·mL-1时，TLR2/4 mRNA表达水平最高。因此初步试验得出低浓度（＜5 μg·mL-1）rTs-HSP70可以诱导静息状态巨噬细胞活化，从而加强宿主抵御旋毛虫感染能力，rTs-HSP70浓度为5 μg·mL-1时，能刺激静息状态下巨噬细胞共刺激分子CD80和CD86高表达，HSP70浓度升高（＞5 μg·mL-1）则对巨噬细胞RAW264.7表现为抑制作用。

LPS是诱导巨噬细胞活化的主要刺激信号，LPS能与靶细胞上TLR结合，促使细胞释放各种炎性因子如TNF-α、IL-2和IL-12等，因此LPS常用于复制细胞炎症模型。本试验应用半定量PCR检测，将HSP70预处理RAW264.7细胞再进行LPS刺激，与单独LPS刺激的巨噬细胞组相比，观察HSP70对LPS刺激的巨噬细胞TLR2/4表达作用。rTs-HSP70预刺激RAW264.7细胞后，可抑制LPS诱导的巨噬细胞TLR2/4 mRNA表达水平，HSP70通过降低巨噬细胞表面受体TLR2/4的表达来抑制LPS介导的细胞信号通过的传导。表明rTs-HSP70可影响LPS与TLRs的相互作用，LPS活化巨噬细胞的主要通路是TLR4/MyD88/NF-κB，推测HSP70可能通过竞争TLR结合位点抑制LPS对巨噬细胞激活效应。

Nomura等研究显示TLR2/4激动剂耐受可能与细胞表面受体表达下调或者与其介导的细胞信号转导通路相关分子表达变化有关[16-17]。已有研究表明肠道线虫感染可改变宿主T细胞活化状态，Bian等研究发现旋毛虫感染抑制宿主诱生一氧化氮合酶表达[18]。旋毛虫HSP70抑制LPS对巨噬细胞活化反应，是否与旋毛虫ES抗原诱导的免疫抑制机理相同，有待于进一步研究。

本试验利用半定量PCR方法和流式细胞术，观察rTs-HSP70对体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7 TLR2/4受体及共刺激分子CD80和CD86表达的影响，结果表明旋毛虫重组HSP70对体外培养小鼠巨噬细胞具有调节功能，至少可通过TLR2和TLR4信号通路发挥作用；旋毛虫重组HSP70可以刺激巨噬细胞共刺激分子CD80和CD86分子的高表达及TLR2/4 mRNA表达升高，从而诱导巨噬细胞活化；半定量PCR方法验证了rTs-HSP70预刺激能引起免疫抑制效应，抑制LPS对巨噬细胞TLR2/4活化反应。

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Effect of 70 ku recombinant HSP70 fromTrichinella spiralison expres-sion of TLR2/4 in murine macrophage

LI Cheng1,YU Yang2,XU Jia2,LIU Cahng2, ZHOUXingdong2,LIXiaoyun2(1.SchoolofLifeSciences,Northeast AgriculturalUniversity,Harbin 150030,China;2.School of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University, Harbin 150030,China)

To observe the effect of 70 kDa recombinant heat shock protein from Trichinella spiralis (rTs-HSP70)on expression of TLR2/4(toll-like receptors)in murine macrophage in vitro.Murine macrophage RAW264.7 cell lines were incubated in twelve-well plates and different concentrations of rTs-HSP70 were added,co-culturing for 24 hours.Then the cells’TLR2/4 expression were tested by semi-quantitative PCR,those of surface markers CD80 and CD86 by flow cytometry.Cells receiving no stimulation were taken as negative control,bacterial lipopolysaccharide(LPS)as positive control.At the same time,comparative studies on incubation with rTs-HSP70 alone,rTs-HSP70 in combination with LPS,were conducted at concentration 5µg·mL-1of HSP70.The results indicated that lower concentrations of rTs-HSP70 had a positive correlation with macrophages activation,TLR2/4 expression peaked at concentration of 5µg·mL-1(P＜0.05),and up-regulation of co-stimulatory molecules.when rTs-HSP70concentration rose above a certain threshold(＞5µg·mL-1),a inhibitory effect on macrophage could be observed.Pre-stimulation of the macrophage with rTs-HSP70 could result in immunosuppression, generating a suppresive effect on LPS in TLR2/4 activation.The study lay the foundation for the mechanisms of helminth molecules immunomodulation and the therapeutic treatment of different trichinellosis.

Trichinella spiralis;macrophages RAW264.7;TLR2;TLR4

S532.14

A

1005-9369（2014）08-0072-07

2012-03-28

国家自然科学基金（31172312）；“十一五”国家科技支撑计划重大项目（2010BAD04B01）

李成（1974-），男，实验师，硕士，研究方向为生物工程技术。E-mail：13304633640@189.cn

时间2014-7-26 13:44:02[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140726.1344.001.html

李成,禹洋,徐佳,等.旋毛虫重组HSP70对小鼠巨噬细胞TLR2/4表达的影响[J].东北农业大学学报,2014,45(8):72-78.

Li Cheng,Yu Yang,Xu Jia,et al.Effect of 70 ku recombinant HSP70 fromTrichinella spiralison expression of TLR2/4 in murine macrophage[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(8):72-78.(in Chinese with English abstract)