张圆林, 王昌禄, 陈勉华, 李风娟, 李贞景, 王玉荣

(天津科技大学食品工程与生物技术学院/食品营养与安全教育部重点实验室,天津 300457)

高产γ-氨基丁酸的红曲霉菌株筛选及发酵条件优化

张圆林, 王昌禄*, 陈勉华, 李风娟, 李贞景, 王玉荣

(天津科技大学食品工程与生物技术学院/食品营养与安全教育部重点实验室,天津 300457)

从实验室保藏的11种红曲霉中,筛选出高产γ-氨基丁酸的红曲霉CH-1菌株.研究了发酵温度、时间、接种量、谷氨酸钠添加量等发酵条件对红曲霉CH-1产GABA含量的影响.经单因素实验及正交试验后得出红曲霉CH-1发酵大米产γ-氨基丁酸的较佳发酵条件为:发酵温度30℃,发酵时间9 d,接种量17%,谷氨酸钠添加量0.10 g,在此条件下,红曲霉CH-1发酵大米产GABA 为1.93mg/g,经高效液相色谱检测,桔霉素含量为0.01μg/g,低于国家标准1μg/g,可利用该产品开发更多形式的红曲食品.

红曲霉;γ-氨基丁酸;发酵

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一种非蛋白质氨基酸,广泛存在于原核生物和真核生物中,在中枢神经系统中是重要的抑制性神经递质[1-2],具有调节心血管活动、改善脑功能、改善肝肾功能、镇静、提高记忆力等多种生理功能[3-10]. GABA作为一种新型的功能性因子,广泛用于食品、医药和饲料工业中[11-14].

目前,GABA的生产方法主要有化学合成法和生物法.化学合成法由于价格昂贵、安全性较低,不适于在食品、药品等工业中应用.生物法包括植物富集法和微生物发酵法,其中微生物发酵法因其成本低、含量高、安全性好等优点,受到了广泛关注[2].红曲霉发酵可产生GABA,还能产生其他功能活性物质,如莫纳可林K(Monacolin K)、色素、麦角甾醇等,大多数红曲霉在代谢过程中还可能产生桔霉素,它是一种具有肾毒性的真菌毒素,对人体有害,其含量直接影响红曲产品的安全性[15-16],因此在红曲霉发酵过程中也应该注意桔霉素含量.

本研究从实验室现有的11种红曲霉菌株中,筛选出一株高产GABA的红曲霉CH-1,研究了温度、时间、接种量、谷氨酸钠添加量等发酵条件对红曲霉产GABA含量的影响.通过单因素实验和正交试验,优化了高产GABA的最佳发酵条件,为进一步开发红曲霉产品提供参考.

1 材料与方法

1.1 菌种与试剂

1.1.1 菌种

实验室保藏红曲霉菌株:M1,M2,M3,M4,M7, CH-1,CH-2,CH-3,CS-1,CS-2,CS-4.

1.1.2 试剂

乙腈、甲醇(色谱纯),德国CNW公司;GABA标准品(纯度≥99%),桔霉素标准品(纯度≥99%),均为美国Sigma公司生产.

1.2 培养基及溶液配制

斜面培养基(g/L):麦芽浸粉140 g,琼脂粉20 g,121℃灭菌20min.

种子液培养基(g/L):葡萄糖60 g,蛋白胨20 g,NaNO310 g,MgSO4·7H2O 5 g,KH2PO410 g,自来水1 000 mL,121℃灭菌20 min(试剂均为分析纯).

固体发酵培养基:大米,购于天津农贸市场;将大米经自来水浸泡过夜,分装入250 mL三角瓶中,每瓶28 g原料,自来水12m L,121℃灭菌20 min.

衍生剂:邻苯二甲醛(OPA)80 mg,β-巯基乙醇80μL,甲醇10mL(OPA及β-巯基乙醇为生化试剂,甲醇为色谱纯).

硼酸缓冲液:硼酸2.47 g,水100 m L,用NaOH 调pH值至10.4(试剂均为分析纯).

1.3 主要仪器

8453型紫外可见分光光度计,美国安捷伦科技有限公司;1200s型高效液相色谱仪(配有紫外检测器、荧光检测器和 B.04.03.SPI87色谱工作站)美国安捷伦科技有限公司;LRH-250-GⅡ型微电脑控制光照培养箱,广东省医疗器械厂.

1.4 实验方法

1.4.1 红曲霉菌种活化

用接种环从不同红曲霉菌株的试管斜面上各挑取一环孢子,接入100 mL种子液培养基中,30℃180 r/min培养36 h后备用.

1.4.2 菌种筛选

在无菌条件下,分别将活化后的菌种培养液进行无菌过滤,计数,将其浓度调整至2×106个/m L.各吸取5 mL,接入固体发酵培养基中,25℃培养5 d,分别进行取样,测定其中GABA含量,筛选出产GABA含量较高的红曲霉菌株.

1.4.3 GABA测定方法

1.4.3.1 标准曲线绘制

将浓度为500μg/mL的GABA标准水溶液,稀释成10,20,50,100,200μg/mL的标准溶液系列.以不同GABA标准水溶液浓度为横坐标,以HPLC法测定的峰面积数值为纵坐标,绘图得到GABA标准曲线.

1.4.3.2 样品处理

取不同红曲霉发酵样品,60℃烘干至恒重,粉碎,过100目筛.准确称取0.500 0 g样品,加入4 mL质量分数为4%的TCA溶液,30℃水浴2 h,转至离心管中,10 000 r/min离心10min,用TCA定容至5mL.吸取1mL经0.45μm滤膜过滤,经在线衍生(2μL样品溶液和2μL衍生剂)8 min,立即进行HPLC检测.

1.4.3.3 色谱条件

色谱柱:Agilent Eclipse AAA(150 mm×4.6 mm,5μm);采用梯度洗脱,流动相A为纯净水,1 L, 加1.6‰醋酸钠(分析纯)调pH值为7.2;流动相B为甲醇∶乙腈∶纯净水=45∶45∶10(体积比),1 L,加1.6‰的醋酸钠,调pH值为7.2;0～2min流动相B 为20%,2～18min流动相B由20%上升至100%,维持4 min,在22～26 min内,流动相B由100%降至20%.检测器为紫外检测器,检测波长为338 nm,柱温为25℃,流速为1mL/min,进样量为2μL.

1.4.4 桔霉素测定方法

1.4.4.1 标准曲线的绘制

将质量浓度为500μg/m L的桔霉素乙腈标准溶液分别配制成质量浓度为0,0.05,0.10,0.50, 1.00,2.00,5.00,10.00 g/mL的标准溶液.以不同浓度的桔霉素标准水溶液浓度为横坐标,以HPLC法测定的峰面积数值为纵坐标,绘图得到桔霉素标准曲线.

1.4.4.2 样品处理

取不同红曲霉发酵样品,60℃烘干至恒重,粉碎,过100目筛.准确称取0.500 0 g样品,置于20 m L离心管中,加入8 mL体积分数75%的乙醇,超声波处理30 min,3 000 r/min离心10 min,重复3 次,合并上清液,定容至25mL,静置30min,经0.45 μm滤膜过滤后用HPLC法检测桔霉素含量.

1.4.4.3 色谱条件

色谱柱,Agilent TC-C18(4.6mm×250mm,5μm);流动相为V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=70∶10∶20(用磷酸调pH值为2.66～2.68);荧光检测器,检测波长λex=331 nm,λem=500 nm;柱温25℃;流速1 mL/min;进样量20μL.

2 结果与讨论

2.1 高产GABA的红曲霉菌株的筛选

不同的红曲霉菌株,GABA的产量不同,结果如图1.

由图1可以看出不同的红曲霉菌株GABA产量多少排序为:CH-1＞CH-2＞CH-3＞M4＞CS-1＞M3＞CS-4＞M1＞CS-2＞M7＞M2,其中红曲霉CH-1产量为0.6mg/g,因此,选择红曲霉CH-1菌株继续深入研究.

图1 不同红曲霉菌株GABA产量Fig.1 GABA yield of different monascus

2.2 发酵条件对γ-氨基丁酸产量的影响

2.2.1 发酵温度对γ-氨基丁酸产量的影响

温度是影响红曲霉生长的一个重要因素,向固体发酵培养基中接入质量分数为15%已调浓度的红曲霉CH-1菌液,分别将其放入21,24,27,30,33℃培养箱中,7 d后取样检测,结果如图2.

图2 发酵温度对GABA产量的影响Fig.2 Effects of fermentation temperature on GABA yield

由图2可知,温度在21～30℃时,红曲霉CH-1发酵大米产GABA的含量随着温度的升高而增加, 在30℃时达到最大,为1.25mg/g,即比21℃培养时提高了2倍.但发酵温度继续提高,GABA的产量下降,可能是由于温度过高时发酵过程中的谷氨酸脱羧酶的活性降低,而降低了GABA的产量.

2.2.2 发酵时间对γ-氨基丁酸产量的影响

向固体发酵培养基中分别接入质量分数为15%已调浓度的红曲霉菌悬液,将其放入温度为30℃的恒温培养箱中,分别于3,6,9,12,15 d取样检测,研究发酵时间对γ-氨基丁酸产量的影响,结果如图3.

由图3可知,在红曲霉发酵过程中,从发酵第3天到第9天过程中,红曲霉CH-1发酵大米产GABA的含量随着时间的延长而增加,在第9天时达到最高,为1.65mg/g;随着时间的继续延长,其产量则随之降低.因此,控制适当的发酵时间,可获得较高的GABA产量.

图3 发酵时间对GABA产量的影响Fig.3 Effects of fermentation time on GABA yield

2.2.3 红曲霉接种量对γ-氨基丁酸产量的影响

向固体发酵培养基中分别接入质量分数为8%,11%,14%,17%,20%已调浓度的红曲霉菌悬液,30℃培养,9 d后取样检测,结果如图4.

图4 红曲霉接种量对GABA产量的影响Fig.4 Effects of monascus inoculum on GABA yield

由图4可知,红曲霉接种量对红曲霉CH-1产GABA影响较大.随着红曲霉接种量的增加,红曲霉CH-1发酵大米产GABA的含量也随之增加,当接种量为17%时,GABA产量最高,为1.83 mg/g.随着接种量的继续增大,GABA的含量略有下降,这可能因为红曲霉接种量较小时,菌种的适应期和对数期会相对延长,处于生长繁殖阶段的菌体的发酵能力较差,导致GABA的产量较低;而红曲霉接种量过多时,会造成其发酵时间缩短,降低了GABA的含量.考虑到GABA的产量及经济成本,最适的红曲霉接种量确定为17%.

2.2.4 谷氨酸钠添加量对γ-氨基丁酸产量的影响

红曲霉发酵过程中能产生谷氨酸脱羧酶,可以促使谷氨酸钠转化为GABA.因此,向固体发酵培养基中分别加入谷氨酸钠的质量为0,0.05,0.10, 0.15,0.20 g,接入质量分数为17%已调浓度的红曲霉菌悬液,将其放置于温度为30℃的恒温培养箱中,培养9 d后取样检测,研究谷氨酸钠添加量对γ-氨基丁酸产量的影响,结果如图5.

图5 谷氨酸钠添加量对GABA产量的影响Fig.5 Effects of sodium glutamate content on GABA yield

由图5可知,随着谷氨酸钠添加量的增加,红曲霉CH-1发酵大米产GABA的含量也随之增加.在谷氨酸钠添加量为0.10 g时,GABA的含量达到最高,为1.92 mg/g.随着谷氨酸钠添加量的继续增大,生成GABA量受到抑制,甚至产量下降.

2.3 正交试验结果与分析

根据单因素实验的结果,以发酵温度、时间、红曲霉接种量、谷氨酸钠添加量进行L9(34)正交试验,确定红曲霉发酵大米产GABA量的最佳发酵参数.正交试验因素与水平设计见表1.

表1 正交试验设计表Tab.1 Factors and levels of orthogonal design

正交试验结果与分析见表2.

利用正交助手进行分析.由极差R得出,4个因素对红曲霉发酵大米产GABA的含量影响程度由高到低顺序为:发酵温度、发酵时间、红曲霉接种量、谷氨酸添加量,由正交试验k值分析可以得知,最优水平为A2B2C2D2.

正交试验方差分析结果见表3.从表3可以看出,发酵温度和发酵时间均为显著因素,其中发酵温度的显著性大于发酵时间的显著性.综合k值和正交实验方差分析结果可得,红曲霉CH-1发酵大米产GABA含量的最佳发酵参数为:发酵温度为30 ℃,发酵时间为9 d,红曲霉接种量为17%,谷氨酸添加量为0.10 g.

表2 L9(34)正交试验设计与结果Tab.2 Orthogonal design and experimental results

表3 正交试验方差分析结果Tab.3 Anova of orthogonal test

2.4 优化后红曲米样品中GABA和桔霉素的含量检测

桔霉素作为一种真菌毒素,对人体有害,若其含量超过0.2μg/g,产品将不能达到国家标准,因此,应检测桔霉素的含量,以保证产品的安全性.采用正交试验所得最佳条件进行验证实验,对所得样品中GABA和桔霉素的高效液相色谱分析结果见图6.由图6(a)可知,红曲霉样品中GABA的保留时间为16.246min,含量为1.93mg;由图6(b)可知,桔霉素的保留时间为4.856min,含量为0.01μg/g,符合国家标准中规定的桔霉素含量必须低于1μg/g的要求.

3 结 论

图6 红曲霉样品中GABA和桔霉素高效液相色谱图Fig.6 HPLC chromatograms of GABA and citrinin in samples

根据实验得知温度和时间对红曲发酵产GABA的含量有显著影响,其较佳发酵条件为:红曲霉接种量17% 、温度30℃、时间9 d、谷氨酸钠添加量0.10 g.在此条件下,红曲霉CH-1产GABA的质量分数为1.93mg/g,比优化前提高了3.22倍,即可望利用红曲霉CH-1进行富含GABA功能因子的多种产品研发,也可通过实验选择合适的粗粮如玉米、小米、燕麦等作为发酵基质,进一步提高发酵物的营养价值;目前国内外常见的GABA类食品多以饮料为主,因此,在丰富GABA类食品种类方面,还需要做大量的研究.

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Screening of High GABA-production by Monascus and Optim ization of its Fermentation Conditions

ZHANG Yuanlin, WANG Changlu*, CHEN Mianhua, LIFengjuan, LIZhenjing, WANG Yurong
(College ofFood Engineering and Biotechnology/Key Laboratory ofFood Nutrition and Safety ofMinistry of Education,Tianjin University ofScience and Technology,Tianjin 300457,China)

To screen high GABA-producing Monascus strains from the laboratory,effects of Monascus inoculum,temperature,time,and the sodium glutamate content on GABA production were studied.Taking the production of GABA as the index,single factors and the orthogonal experimentwere implemented to attain the optimum fermentation conditions,the temperature of Monascus CH-1 30℃,optimum fermentation time nine days,optimum inoculation 17%,and optimum dosage of sodium glutamate 0.10 g. The GABA yield by Monascus CH-1 was1.93mg/g and the citrinin contentwas0.01μg/g below the national standards.Themore forms of red kojic rice food product can be developed.

monascus;γ-aminobutyric acid;fermentation

叶红波)

TS201.3

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2014.05.007

2095-6002(2014)05-0035-06

张圆林,王昌禄,陈勉华,等.高产γ-氨基丁酸的红曲霉菌株筛选及发酵条件优化.食品科学技术学报,2014,32 (5):35-40. ZHANG Yuanlin,WANG Changlu,CHEN Mianhua,et al.Screening of high GABA-production by Monascus and optimization of its fermentation conditions.Journal of Food Science and Technology,2014,32(5):35-40.

2013-12-28

国家自然科学基金资助项目(31171729).

张圆林,女,硕士研究生,研究方向为食品生物技术;*王昌禄,男,教授,博士生导师,主要从事食品生物技术方面的研究.通讯作者.