陈文材，刘玲飞，吴 双，刘佳微，党瑜慧，张 洁，李芝兰

兰州大学公共卫生学院，兰州 730000

芹菜素(Apigenin，AP)是一种常见的黄酮类化合物，具有广泛的生物学功能和药理作用，与其他黄酮类化合物相比具有低毒、低诱变性等特点。现阶段国内外对芹菜素的研究主要集中在抗氧化、抗肿瘤等方面，随着应用价值的增加，芹菜素的开发利用成为学者关注的重点。研究发现，芹菜素能够影响小鼠精子运动参数［1］;也可抑制小鼠生精上皮细胞的有丝分裂［2］;此外，有研究表明芹菜素可抑制附睾中精子的透明质酸酶活性，使受精过程发生障碍［3］。本次实验旨在研究大剂量芹菜素对大鼠睾丸氧化还原平衡及睾丸标志酶的影响并探讨其作用机制，为芹菜素的合理开发利用及其安全性提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验对象

SPF 级成年健康雄性SD 大鼠48 只，体重180～200 g，动物合格证号:SCXK(甘)2011-0001-0001176，购于甘肃中医学院医学实验动物中心［实验中心合格证号:SCXK(甘)2011-0001-0002756］，动物饲养于SPF 级实验室内，恒温、恒湿、普通饲料喂养。

1.2 主要试剂与仪器

芹菜素(AP，产品批号:HK20120405)购于陕西慧科植物开发有限公司，纯度为98.11%，用生理盐水配置成所需浓度。试剂盒:总超氧化物歧化酶(SOD，20121227)，过氧化氢酶(CAT，20130103)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px，20121227)，丙二醛(MDA，20130103)，总抗氧化能力(T-AOC，20121229)，超微量ATP酶(Ca2+Mg2+-ATP，20130116)，超微量Na+K+-ATP 酶(Na+K+-ATP，20130106)，一氧化氮合酶(NOS，20121227)，乳酸脱氢酶(LDH，20121225)，酸性磷酸酶(ACP，20121227)，碱性磷酸酶(AKP，20121225)，考马斯亮兰试剂盒(20121226)购于南京建成生物工程研究所。酶联免疫试剂盒:山梨醇脱氢酶(SDH，20130114)，谷胱甘肽(GSH，20130114)购于上海晶天生物工程有限公司。主要仪器:安图酶标仪(郑州安图生物技术有限公司，型号Anthos 2010)，722型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。

1.3 实验方法

大鼠按体重随机分为对照组、芹菜素低、中、高剂量组，每组12 只，分别灌胃给予生理盐水10 mL/kg·bw、等体积的芹菜素234、468、936 mg/kg·bw，每天一次，连续35 d。于末次灌胃24 h 后称重、处死大鼠，迅速摘取睾丸、附性腺组织(SAT，包括阴茎、前列腺、精囊腺、肛提肌/球海绵体肌、尿道球腺)并称重，-20 ℃保存。

1.4 睾丸组织匀浆的制备及指标测定

睾丸去除被膜及血管，置于玻璃匀浆器中，用0.86% NS 制成质量浓度为10%的组织匀浆，于离心机中4 ℃，3000 rpm 离心10 min，弃去沉渣，取上清液。按照试剂盒提供的说明书测定各项指标。

1.5 统计学分析

2 实验结果

2.1 芹菜素对大鼠睾丸脏器系数、附性腺组织湿重的影响

芹菜素灌胃35 d，低、中、高剂量组睾丸脏器系数和附性腺组织(SAT，包括阴茎、前列腺、精囊腺、肛提肌/球海绵体肌、尿道球腺)湿重与对照组比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。如表1 所示。

表1 芹菜素对大鼠睾丸脏器系数、附性腺组织湿重的影响(n=12±s)Table 1 Effect of apigenin on organ coefficient of testis and wet weight of accessory sex organs of rats(n=12±s)

表1 芹菜素对大鼠睾丸脏器系数、附性腺组织湿重的影响(n=12±s)Table 1 Effect of apigenin on organ coefficient of testis and wet weight of accessory sex organs of rats(n=12±s)

注:与对照组比较，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01。Note:Compared with control，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

2.2 芹菜素对大鼠睾丸氧化还原平衡的影响

低剂量组SOD 和中剂量组GSH-Px 酶活力与对照组比较降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。低剂量组芹菜素降低SOD/(GSH-Px +CAT)，中、高剂量组升高SOD/(GSH-Px +CAT)，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。见表2。

表2 芹菜素对大鼠睾丸SOD、GSH-Px、CAT 活力的影响(n=12±s)Table 2 Effect of apigenin on activities of SOD，GSH-Px and CAT in testis of rats(n=12±s)

表2 芹菜素对大鼠睾丸SOD、GSH-Px、CAT 活力的影响(n=12±s)Table 2 Effect of apigenin on activities of SOD，GSH-Px and CAT in testis of rats(n=12±s)

注:与对照组比较，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01。Note:Compared with control，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

低剂量和中剂量芹菜素能够升高T-AOC，而高剂量芹菜素则降低T-AOC 水平，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。各剂量组GSH 活性与对照组比较均有明显的下降，差异有统计学意义(P＜0.05)，且与芹菜素剂量呈负相关(P＜0.01)。低剂量组MDA 含量低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。如表3 示。

表3 芹菜素对大鼠睾丸T-AOC 活力和MDA、GSH 含量的影响(n=12±s)Table 3 Effect of apigenin on activity of T-AOC and content of MDA，GSH in testis of rats(n=12±s)

表3 芹菜素对大鼠睾丸T-AOC 活力和MDA、GSH 含量的影响(n=12±s)Table 3 Effect of apigenin on activity of T-AOC and content of MDA，GSH in testis of rats(n=12±s)

注:与对照组比较，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01。Note:Compared with control，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

2.3 芹菜素对大鼠睾丸标志酶活性的影响

低、中、高剂量组芹菜素使ACP、AKP、LDH 活力降低，与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。见表4。

表4 芹菜素对大鼠ACP、AKP、LDH 活力的影响(n=12±s)Table 4 Effect of apigenin on activities of ACP，AKP and LDH in testis of rats(n=12±s)

表4 芹菜素对大鼠ACP、AKP、LDH 活力的影响(n=12±s)Table 4 Effect of apigenin on activities of ACP，AKP and LDH in testis of rats(n=12±s)

注:与对照组比较，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01。Note:Compared with control，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

由表5 可见，低、中、高剂量组芹菜素能升高Ca2+Mg2+-ATP，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。高剂量组Na+K+-ATP 相比对照组升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。各剂量组SDH、NOS 活力与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

本实验条件下，234、468、936 mg/kg AP 灌胃35 d，大鼠未见明显的不适症状，也未出现死亡;各剂量组芹菜素对大鼠睾丸脏器系数和附性腺组织重量无影响。提示芹菜素对大鼠睾丸和附性腺组织无明显毒性。

正常生理状态下，机体代谢产生的活性氧自由基在体内抗氧化酶及外源性和内源性的抗氧化剂共同作用下清除，维持对机体有利无害的动态平衡。当平衡被破坏，自由基的生成超过机体的清除能力，过量的自由基便在体内蓄积，并攻击生物膜引发脂质过氧化反应，从而引起细胞代谢及功能障碍，对机体产生毒害作用。SOD、CAT、GSH-Px 为生物机体组织中重要的抗氧化酶。SOD 主要功能是使超氧自由基歧化生成H2O2;CAT 的生理作用是催化H2O2分解为O2和H2O，使细胞免遭H2O2的毒害;GSH-Px 主要生物学作用是清除脂质氢过氧化物，在CAT 含量少的组织，可代替CAT 清除H2O2。SOD/(GSH-Px+CAT)可用来反映机体自由基含量水平，比值升高提示机体自由基水平较高，反之则为较低［4］。T-AOC 为机体总抗氧化能力的指标，其与抗氧化酶的活性、MDA 含量三者共同反映机体脂质过氧化水平。

表5 芹菜素对大鼠睾丸SDH、Na +-K +-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、NOS 活力的影响(n=12±s)Table 5 Effect of apigenin on activities of SDH，Na +-K +-ATP，Ca2+-Mg2+-ATP and NOS in testis of rats(n=12±s)

表5 芹菜素对大鼠睾丸SDH、Na +-K +-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、NOS 活力的影响(n=12±s)Table 5 Effect of apigenin on activities of SDH，Na +-K +-ATP，Ca2+-Mg2+-ATP and NOS in testis of rats(n=12±s)

注:与对照组比较，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01。Note:Compared with control，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

芹菜素有直接清除自由基，螯合过渡态金属离子(Fe2+、Cu2+等)和抑制NO 的生成等作用，使羟自由基(·OH)合成减少，最终MDA 生成减少。本实验条件下，AP 236 mg/kg 处理组SOD/(GSH-Px +CAT)降低，T-AOC 升高、MDA 降低，提示236 mg/kg AP 主要表现出抗氧化作用，大鼠睾丸总抗氧化能力升高，自由基或ROS 减少，此时睾丸组织内自由基水平不高，抗氧化酶表达水平较低。此外，大鼠睾丸中的GSH 含量明显下降，可能是GSH 在过氧化物酶作用下被芹菜素协同氧化的结果［5］。

468 mg/kg AP 灌 胃35 d，SOD/(GSH-Px +CAT)、T-AOC 升高、GSH 降低。提示此剂量下，大鼠睾丸组织自由基水平升高，SOD 等抗氧化酶表达升高，外源性的抗氧化剂和抗氧化酶活性的增加导致T-AOC 升高。此时，芹菜素的抗氧化作用大于促氧化作用。936 mg/kg AP 灌胃35 d，SOD/(GSH-Px+CAT)升高，T-AOC 降低，GSH 降低。提示本剂量条件下，大鼠睾丸自由基水平升高，总抗氧化能力反而降低，GSH 消耗明显高于AP 236、468 mg/kg 剂量组，芹菜素促氧化作用大于抗氧化作用。

ACP 主要存在于睾丸支持细胞内，主要功能是清除受损或衰老的细胞，其生成减少与生精上皮和睾丸支持细胞的变性有关［6］，是精子形成障碍的标志之一。AKP 与睾丸生精细胞的分裂密切相关，并参与生精细胞营养物质的转运［6］。LDH 和SDH 广泛分布在生精小管和生精细胞中，LDH 是精子能量代谢必需的酶，其活性与生精上皮成熟，各级生精细胞代谢及精子活动、获能有关，化学性诱导应激可导致LDH 活性升高［7］。SDH 作为参与三羧酸循环的关键酶，同时参与组织的代谢、分泌和营养物质的吸收，其活性对于评价精子线粒体功能具有重要意义［7］。一氧化氮(NO)是体内目前已知的重要的气态信号配体，其在睾丸组织内不仅参与睾丸微循环的调节、睾酮的分泌，而且对精子的发生、活动及受精能力均有重要作用。由于其半衰期短，一般用NOS 来评价。ATP 酶存在于细胞膜上，是物质转运和信号传导的载体。ATP 在睾丸线粒体的分解代谢取决于Ca2+Mg2+-ATP 酶的活性，而Ca2+Mg2+-ATP可因生精细胞的变性而升高［4］。

本次实验结果:AP 234、468、936 mg/kg 剂量组，LDH、ACP、AKP 酶的活性均有明显的降低，而Ca2+Mg2+-ATP 酶在AP 234、468、936 mg/kg 组升高，提示本实验条件下，芹菜素能抑制雄性大鼠生精及精原细胞分裂过程，其机制与生精细胞变性及能量代谢异常有关。本次研究观察到芹菜素具有抗氧化和促氧化的双重作用，与相关报道一致［8］。芹菜素在234、468 mg/kg 剂量时，抗氧化作用占主导，与其本身具有良好的自由基清除能力有关，睾丸组织内产生的自由基一定程度上能被芹菜素和抗氧化酶系统所清除;而在936 mg/kg 剂量时，因芹菜素的氧化形式半苯醌与GSH 和NADPH 等的协同氧化作用产生过多的自由基［9］，导致维持机体自由基平衡的系统受到破坏，机体自由基水平升高，表现出促氧化作用。抗氧化酶是机体中重要的自由基清除剂，正常活性的抗氧化酶促进生殖细胞的发育与分化，活性异常则可能导致生精过程障碍［10］。结合本实验中大鼠精子质量的观察结果:936 mg/kg 处理组d级精子密度显著增大，精子活力、活率降低、不动率增大，VCL、VSL、STR 降低，BCF 升高(结果可见相关文章)。提示936 mg/kg 芹菜素引起抗氧化酶、睾丸标志酶活性异常所致生精过程障碍，可降低大鼠精子质量。

综上，在本实验中，936 mg/kg 芹菜素在睾丸组织虽然表现出促氧化作用，但对大鼠睾丸脂质过氧化损伤不明显，同时可降低大鼠精子质量，为芹菜素的抗生育作用的合理开发利用提供现实的指导意义。

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