徐 冬 吕晓伟 毕作木 任国华 王鲁群

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）约占血液系统疾病的10%，是起源于B淋巴细胞的恶性肿瘤。新型的靶向治疗药物，如蛋白酶体抑制剂硼替佐米在提高缓解率、改善生活质量及延长患者寿命方面均优于传统治疗［1-3］。但是仍有相当部分患者疗效较差，有待于我们发现新的治疗靶点。Hurt等［4］发现，约50%骨髓瘤患者样本中c-maf存在高表达。生理情况下，c-maf蛋白在浆细胞的细胞粘附、移动，细胞周期调控等生理过程中发挥作用。本研究利用RNAi技术沉默多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226的c-maf基因，观察其对多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226的增殖和侵袭力的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞株：潍坊医学院冯永堂教授惠赠。Matrigel胶：BD公司产品，Tran-swell小室：Coster公司产品，c-maf干扰序列及对照序列：Qiagen公司产品，小鼠抗人 survivin、MMP-2、MMP-9、β-actin、ARK5、cyclin B1单克隆抗体均购自美国Santa cruz公司，HPR标记山羊抗小鼠IgG购自北京鼎国生物公司，细胞总蛋白提取试剂盒：北京康成生物公司产品，Caspase-3/7活性检测试剂盒：美国Promega公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞复苏与培养 37℃水浴箱中复苏细胞，成功后置于CO2培养箱培养传代。

1.2.2 脂质体法转染多发性骨髓瘤细胞系 实验分组：实验组（c-maf siRNA组）；阴性对照组（NC siRNA组）；空白对照组（mock siRNA组）。24孔培养板中将siRNA、脂质体混合液100 μL按照不同的试验分组进行转染，镜下观察转染效果。

1.2.3 RT-PCR检测c-maf基因的表达 逆转录、扩增目的基因。PCR反应条件：94℃变性45s，56℃退火50s，72℃延伸1 min，共25个循环。表达抑制率计算公式：表达抑制率（%）=（1-c-maf条带平均灰度值/β-actin条带平均灰度值）×100%。引物序列：c-maf：P1 5'-AGCG GCTTCCGAGAAAAC-3'，P2 5'-ACTTGCGAGTGGGCTC AG-3'；β-actin：P1 5'-GACTGCCTGCCTCACTTT-3'，P2 5'-GCTGATCTCGGCTCTGT-3'。

1.2.4 MTT法检测细胞增殖抑制效应 分别取培养1～7d各组细胞行MTT实验。以时间为横坐标，各组OD值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.2.5 Transwell小室侵袭试验 Matrigel胶包被Transwell小室上室面。取转染后24 h的各组细胞1×105个移到无血清培养基中，放入Transwell小室上层。下室加入含15%胎牛血清的培养基，置5%CO2培养箱24 h。取出Transwell小室，倒置显微镜下计数下室面10个高倍视野细胞数，取平均值。

1.2.6 细胞周期检测 收集转染后0、24、48、72 h各组细胞，乙醇固定过夜，RNA酶水浴消化后加入碘化丙啶（PI，50 μg/mL），4℃放置15 min后流式细胞仪检测。

1.2.7 Western blot检测 survivin、MMp-2、MMP-9、ARK5、cyclin B1蛋白表达PBS漂洗、裂解细胞，蛋白质定量、分离后PVDF膜上免疫杂交，洗涤后将滤膜与标记的抗免疫球蛋白抗体温育。发光法确定靶蛋白数值。

1.2.8 Caspase活性检测 取培养1、2、3 d的各组细胞，按照试剂盒的操作说明将缓冲液与底物混合，混合物100 μL加入等体积培养的细胞悬液后孵育3 h，酶标仪检测并计算Caspase活性。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 倒置荧光显微镜下观察转染后的细胞

在荧光显微镜下观察实验细胞，绝大多数细胞都荧光着色，与背景反差明显，荧光着色细胞有明显的细胞轮廓（图1）。

图1 转染24 h后倒置荧光显微镜下观察转染后实验细胞（×100）Figure 1 MM cells under the fluoroscope at 24 h after transfectedion（×100）

2.2 RT-PCR检测c-maf基因的表达

实验组条带亮度较阴性对照组和空白对照组明显弱（图2）。表达抑制率：c-maf siRNA组：76.38%±7.36%，NC siRNA组：44.01%±6.31%，mock siRNA组38.66%±6.95%，差异有显著统计学意义（P＜0.05，表1）。

图2 c-maf siRNA对多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226 c-maf基因表达的影响Figure 2 Effect of siRNA on c-maf mRNA expression in RPMI8226 cells

表1 c-maf siRNA抑制c-maf基因的表达Table 1 siRNA inhibits c-maf mRNA expression in RPMI8226 cells

2.3 MTT法检测各组细胞的增殖活性

转染c-maf siRNA后第1、2d，各实验组增殖活性无明显差异，48 h的OD值，c-maf siRNA组：0.65±0.07，NC siRNA 组：0.66±0.11，空白对照组：0.65±0.17，无统计学差异（P＞0.05），c-maf siRNA组较其他两组在第3～7d出现差异，第5d差异最明显，此时c-maf siRNA组OD值：0.67±0.08，NC siRNA组OD值：0.74±0.12，空白对照组OD值：0.75±0.29，比较有统计学差异（P＜0.05）。以时间为横轴、OD值为纵轴绘制生长曲线（图3）。7d后由于培养基营养成分消耗，失去统计意义。

2.4 沉默c-maf基因对人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226体外侵袭力的影响

增殖抑制实验表明，c-maf基因沉默后第3d开始出现显著差异。因此，为了减少细胞增殖对侵袭力实验的影响，检测侵袭力的实验选定在转染后24～48 h进行。结果显示c-maf siRNA组、NC siRNA组、空白对照组粘附于下室面的细胞数量分别为：35.66±5.09、57.01±10.22、60.33±9.63。c-maf siRNA组与其余二组对比，差异有统计学意义（P＜0.05，图4）。

2.5 流式细胞术检测细胞周期变化

c-maf siRNA组在转染后3天G2/M期比例逐渐增加，由16.20%升至51.10%，细胞周期阻滞在G2/M期。c-maf siRNA组的细胞周期图出现亚二倍体凋亡峰（图5，表2）。

2.6 Western blot检测蛋白表达

Western blot检测转染72 h后，c-maf siRNA组、NC siRNA组、空白对照组的不同蛋白表达水平，结果示c-maf siRNA组 Survivin、MMP-2、MMP-9、ARK5、cyclin B1均明显低于其他两组（P＜0.05，图6）。

2.7 Caspase-3/7蛋白活性检测

转染后，随着时间延长c-maf siRNA组细胞的Caspase-3/7的活性逐渐增高，转染0、24、48、72 h，各实验组 Caspase-3/7活性为：c-maf siRNA：0.314±0.029、0.468±0.039、0.636±0.052、0.786±0.081，NC siRNA：0.314±0.029、0.350±0.035、0.361±0.033、0.373±0.038，Mock siRNA：0.314±0.029、0.348±0.026、0.357±0.033、0.370±0.034。c-maf siRNA组和其他二组比较差异有统计学意义（P＜0.05，图7）。

图3 转染c-maf siRNA对人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226增殖的影响Figure 3 The growth curve according to the MTT assay in different groups of RPMI8226 after transfection with c-maf siRNA

图4 c-maf基因沉默对人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226体外侵袭力的影响（*P＜0.05）Figure 4 The effect of c-maf siRNA on in vitro invasion activity of RPMI8226 cells

图5 c-maf基因沉默对人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226细胞周期的影响Figure 5 The effect of c-maf siRNA on cell cycle progression of RPMI8226

表2 转染后不同时间G2/M期细胞数量比例 （%）Table 2 The percentage of RPMI8226 cells in G2/M phase at different time points（%）

图6 转染后RPMI8226细胞的survivin、MMP-2、MMP-9、ARK5、cyclin B1蛋白表达的差异Figure 6 The expression of survivin,MMP-2,MMP-9,ARK5,and cyclin B1 protein in RPMI8226 cells after transfection

图7 转染后RPMI8226细胞的Caspase-3/7蛋白活性的差异Figure 7 The change of Caspase-3/7 protein activity in RPMI8226 cells after transfection

3 讨论

如前所述，c-maf基因在50%骨髓瘤患者标本中异常高表达。研究显示［5-7］，转染外源性c-maf基因的小鼠B细胞可发展为MM。在高表达c-maf的MM细胞中，c-maf蛋白分子可促进新血管的生成；增加MM细胞的迁移力；提高对周期特异性化疗药的耐受性等。临床资料显示［8］，c-maf基因高表达者的肿瘤负荷较高，对传统化疗的有效率较差，导致总体生存和无进展生存较短。所以，c-maf基因高表达是MM患者的预后不良因素。

在细胞周期检测中，沉默c-maf基因后细胞发生了G2/M期阻滞，提示c-maf蛋白是通过促进细胞周期诱导细胞增殖。细胞周期蛋白研究较多的是Cyclin D。但Park等［9］证实在多发性骨髓瘤细胞中有cyclin B的高表达。Tamura等［10］进一步研究证实，cyclin B1表达水平较高的MM患者，有较快的细胞增殖速率，在相同的化疗周期间隔下，容易复发，所以对cyclin B1高表达患者建议缩短化疗间隔。本实验证实抑制c-maf基因的表达能下调cyclin B1，使细胞周期阻滞，所以靶向c-maf的药物能减缓MM细胞的增殖速率，减少化疗次数，降低复发率。凋亡峰的出现说明c-maf也抑制了RPMI8226细胞的凋亡。细胞凋亡的共同途径是Caspase的激活，Caspase酶是凋亡过程的主要调控蛋白，Caspase-3是多种凋亡途径共同作用的因子，其表达水平的高低决定着细胞凋亡程度［11］。Survivin是公认的凋亡抑制基因。本实验发现，转染c-maf siRNA的RPMI8226细胞Survivin蛋白表达水平降低，而Caspase-3/7活性增高，提示沉默c-maf基因诱导RPMI8226细胞凋亡与上调Caspase-3/7和下调Survivin基因表达有关。ARK5（AMPL-related protein kinase 5）是AMPK（AMP-activated protein kinase）的亚家族成员之一，ARK5在各种肿瘤细胞系中表达。有研究［12，13］证实把 ARK5基因转染到乳腺癌细胞MDA-MB-231，增强了其侵袭和转移的能力，而沉默内源性ARK5基因则细胞侵袭转移能力降低，并且细胞侵袭力和MMP-2、MMP-9蛋白的表达呈正相关。Chen等［14］在人非小细胞肺癌细胞中也得到了相似的结果。Morito等［15］发现在ARK5基因启动子区有两个MARE序列，使c-maf蛋白分子能与之结合，上调ARK5基因的表达。所以，ARK5是c-maf的下游靶基因。本研究发现，在沉默c-maf基因后ARK5、MMP-2、MMP-9的蛋白表达均明显降低，提示在RPMI8226细胞中c-maf基因很可能是通过上调ARK5基因而高表达MMP-2、MMP-9从而获得较强的侵袭活性。所以靶向c-maf基因的治疗可通过下调ARK5进而降低MMP-2、MMP-9的水平，降低瘤细胞的侵袭力，从而降低患者体内瘤细胞负荷，减少髓外转移、改善患者预后。

综上所述，本实验证实了通过沉默c-maf的表达可明显抑制多发性骨髓瘤RPMI8226细胞的增殖及侵袭力并诱导其凋亡，结合c-maf在增强多发性骨髓瘤细胞粘附、迁移和血管发生等方面的作用，我们认为靶向c-maf的治疗是可行的，将有可能成为MM基因治疗的一种新的选择。

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