柱后光化学衍生高效液相色谱法同时测定牛奶中黄曲霉毒素

2013-12-24王韦岗

化学分析计量 2013年3期

王韦岗

（镇江市产品质量监督检验所，江苏镇江 212132）

黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，是一种常见的腐生真菌，多见于发霉的粮食、粮食制品及其它霉腐的有机物上，其主要存在形式为B1，B2，G1，G2。在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1最为常见，其毒性和致癌性最强。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为一级致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质［1］。研究表明，长期食用被黄曲霉毒素污染的食物将导致肝癌、胃癌、肠癌等疾病，为了防止黄曲霉毒素危害人类健康，世界各国对黄曲霉毒素在食品中的残留限量做了严格的规定［2］。

黄曲霉毒素的检测方法主要有薄层色谱法、酶联免疫法和高效液相色谱法［3-5］。刘晓茂等［6］采用超高压液相色谱串联质谱法测定食用植物油中的黄曲霉毒素，该方法具有灵敏度高、选择性强和定量结果准确等优点，但仪器较为昂贵，使用成本高，很难普及应用，且净化过程繁琐，需要消耗大量有机溶剂。笔者采用Mycosep 228 Afl aPat多功能净化柱处理样品，应用光化学衍生，结合高效液相色谱法同时测定牛奶中的黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2。该法具有操作简单、速度快、消耗溶剂少等优点，为实验室开展黄曲霉毒素的检测提供参考方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Waters e2695型，主要包括2475荧光检测器、柱温箱、自动进样器、自动脱气四元梯度泵等，美国Waters公司；

光化学衍生器：HM11104型，北京华安麦科生物技术有限公司；

氮气吹干仪：HP-5016型，上海洛成分析仪器有限公司；

漩涡混匀器：IKA MS3 basic型，德国IKA公司；

离心机：TDZ5-WS型，长沙湘智离心机仪器有限公司；

超生波清洗机：SB-800DT型，宁波新芝生物科技有限公司；

超纯水系统：Milli-Q型，美国Millipore公司；

多功能净化柱（MFC）：Mycosep 228 Afl aPat，美国Romer Labs公司；

甲醇、乙腈：色谱纯；

黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2标准品：2.0 μg／mL，美国Sigma公司；

实验用水为Millpore超纯水系统制得。

1.2 仪器分析条件

色谱柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-乙腈-水（体积比为25∶20∶55），流速为1.0 mL／min；进样体积：20 μL；柱温：30℃；荧光检测器：激发波长355 nm，发射波长430 nm。

1.3 样品预处理

准确称取5 g（精确到0.01 g）试样至50 mL具塞离心管中，加入25 mL乙腈-水混合溶液（体积比为80∶20），漩涡混匀后超声提取30 min，以4 000 r／min离心10 min，吸取10 mL上清液至多功能净化柱的玻璃试管中，将装有填料的多功能净化柱插入玻璃试管，并缓慢推动多功能净化柱至玻璃试管的底部，上清液通过多功能净化柱中的填料并与填料充分接触，移取1 mL通过多功能净化柱的净化液于另一玻璃试管中，60℃加热,氮气吹干，再加入1 mL流动相溶解混匀，经0.45 μm滤膜过滤后进样分析。

2 结果与讨论

2.1 净化方法

多功能净化柱（MFC）是一种特殊的固相萃取柱，其填料中含有亲脂性（非极性）和电荷活性（极性）成分，可选择性吸附样品提取液中的脂类、蛋白质类化合物和碳水化合物等干扰物质，而让待测化合物通过净化柱，从而达到分离纯化的目的［7］。多功能净化柱操作简便，不需要进行活化、淋洗和洗脱等操作，缩短了样品的前处理时间。笔者选用美国Romer Labs公司的Mycosep 228 Afl aPat多功能净化柱，对牛奶样品中的黄曲霉毒素进行分离纯化，取得了十分理想的效果。

2.2 提取方法

样品的提取方法主要根据其物理化学性质来确定。黄曲霉毒素易溶于极性溶剂而不溶于非极性溶剂，且在中性溶液中较稳定，一般使用甲醇、乙腈、丙酮、氯仿或几种有机溶剂的混合液对黄曲霉毒素进行提取。黄曲霉毒素虽然难溶于水，但是提取液中少量的水可以润湿基质，增强有机溶剂在样品中的渗透能力，因此采用有机溶剂与水的混合溶液作为提取剂，可以提高样品的提取效率。分别以乙腈-水体积比为20∶80，40∶60，60∶40，80∶20和100∶0为提取剂对牛奶中黄曲霉毒素进行提取，结果表明，以乙腈-水体积比为80∶20时的提取效率最高，回收率在85%以上。

2.3 衍生方法

高效液相色谱法已经成为检测黄曲霉毒素的主要测定方法，但是黄曲霉B1和G1的荧光强度较弱，且黄曲霉毒素B1在水溶液中会发生荧光淬灭，因此需要采用衍生的方法增强B1和G1的荧光强度。常用的衍生方法有柱前三氟乙酸衍生［8］、柱后碘衍生［9］等，但衍生过程复杂、检测灵敏度及重现性受人为因素影响较大。本实验利用环状化合物在紫外光照射下能产生荧光这一特性，采用光化学衍生技术，以流动相中的水作为衍生剂，对黄曲霉毒素进行衍生化处理，使流动相中的水与黄曲霉毒素B1作用，生成荧光特性更强、更稳定的化合物，从而解决了黄曲霉毒素B1在水溶液中发生荧光淬灭的问题，而且增加了黄曲霉毒素的荧光强度［10］。

2.4 线性范围和检出限

分别称取适量黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2标准品溶于甲醇，配成质量浓度为60 ng／mL的标准储备液。吸取适量体积黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的标准储备溶液，用流动相稀释配成相应浓度的混合标准溶液，并按选定的色谱条件进行分析。结果表明，黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的质量浓度与其峰面积具有良好的线性关系，其相关系数在0.999 4～0.999 9之间，相应的线性回归方程见表1。在空白牛奶样品中加入标准品，按上述方法处理样品，根据3倍信噪比（S／N）峰的响应值计算，得到黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的检出限分别为0.50，0.10，0.50，0.10 μg／kg。牛奶加标样品的色谱图见图1。

表1 黄曲霉毒素的线性回归方程和方法检出限

图1 牛奶加标样品的色谱图

2.5 回收试验与精密度试验

在牛奶空白样品中加入3组不同浓度水平的黄曲霉毒素标准溶液，按实验方法进行样品处理和测定，考察实验方法的回收率，并对加标样品重复测定6次，考察实验方法的精密度，结果见表2。结果表明，黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的回收率为85.6%～92.0%，测定结果的相对标准偏差（RSD）为1.72%～3.52%。

3 结语

建立了一种以高效液相色谱-荧光检测器同时检测牛奶中黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的方法。采用Mycosep 228 Afl aPat多功能净化柱对牛奶样品中的黄曲霉毒素进行分离纯化，并用柱后光化学衍生技术增加黄曲霉毒素的荧光强度。该方法具有简便、快速、准确、灵敏度高等优点，为牛奶中黄曲霉毒素的检测提供了实用的技术手段。