何芳，孔祥虹，，何强，高军刚

（1.陕西师范大学，西安 710061；2.陕西出入境检验检疫局，西安 710068）

陕南地处秦巴山区之间，水资源丰富，地理条件复杂，具有生产和发展中药材得天独厚的条件和丰富的资源，素有“生物基因库”和“天然药库”之称，是全国中药材的传统产地和集散地之一。

中药材在生长和储存过程中容易受到病虫害的影响，大多使用化学农药进行防治，因此在中药材中会存在农药残留问题［1-3］。中药材的质量评价不仅包括有效成分，还包括一些外源性的污染物［4］，如农药、重金属、微生物等，其中农药残留问题引起世界各国的高度重视。

目前有关中药材中农药残留分析的方法主要有气相色谱法（GC）［4］、气相色谱-质谱法（GCMS）［5］、高效液相色谱法（HPLC）［6］、高效液相色谱法-质谱法（HPLC-MS）［7-8］等。气相色谱-质谱联用仪由于具有较高的灵敏度和较强的定性能力，成为目前农药多残留同时检测的主流分析仪器，可以实现数百种农药同时检测［9-10］。中药材基质复杂，在进行农药残留分析时通常需要对样品提取液进行净化。农药残留的净化技术主要有液-液萃取；固相萃取和凝胶渗透色谱（GPC）等方法。凝胶渗透色谱（GPC）作为一种新型的样品净化技术，已经成功地应用于各类样品中农药的多残留分析，但应用于中药材中农药多残留的分析较少。笔者采用GPC或GPC-SPE净化样品，气相色谱-质谱法（GC-MS）作为检测仪器，建立了GC-MS同时测定陕南中药材中81种农药残留的检测方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

气相色谱-质谱仪：7890A／5975C型，美国Agilent公司；

凝胶渗透色谱净化系统：GPC ultra 10836型，德国LCTech公司；

超纯水制备仪：Mill-Q型，美国Millipore公司；

乙二胺-N-丙基甲硅烷（PSA）固相萃取小柱：300 mg／3 mL，使用前用5 mL乙腈活化并保持柱体湿润，美国Agilent公司；

乙腈、环己烷、乙酸乙酯、丙酮和正己烷：色谱纯，美国TEDIA公司；

氯化钠和无水硫酸钠：分析纯，美国Sigma公司；

81种农药标准品：包括有机磷类、有机氯类、氨基甲酸酯类农药，纯度不小于97℅，美国Sigma公司；

中药材均购自陕南地区。

1.2 标准溶液配制

准确称取适量各种农药标准品，用含0.1%乙酸的乙腈溶解，配制成浓度为1 000 μg／mL的单标储备液，贮存于4℃冰箱中备用。

分别准确移取上述81种农药化合物单标储备液500 μL于50 mL容量瓶中，用含0.1%乙酸的乙腈定容，配制成浓度均为10 μg／mL的混合标准溶液。用含0.1%乙酸的乙腈逐级稀释得到1.0，0.1，0.05，0.02，0.01 μg／mL的系列混合标准工作液，贮存于4℃冰箱中备用。

1.3 样品前处理

1.3.1 样品提取

取中药材样品自然阴干，用高速粉碎机粉碎，过250 μm（60目）筛，称取6 g（精确至0.01 g）样品至50 mL聚丙烯离心管中，加入6 g NaCl，25 mL超纯水混匀，超声浸泡30 min。加入15 mL含0.1%乙酸的乙腈，振荡20 min，以4 500 r／min离心6 min，取10 mL上清液至50 mL鸡心瓶中，旋转蒸发至近干，氮气吹干，用乙酸乙酯-环己烷（体积比为1∶1）10 mL溶解残渣，过滤纸至GPC进样瓶中，待净化。

1.3.2 样品净化

对于天麻样品采用净化法1——凝胶渗透色谱（GPC）净化；杜仲、金银花、山茱萸等样品采用净化法2——GPC-SPE固相萃取进行净化。

（1）净化法1（天麻）GPC净化条件。凝胶柱：内径25 mm，柱长400 mm，填料为Bio-Beads-S-X3 Beads（38～74 μm）或相当者；流动相：乙酸乙酯-环己烷（体积比为1∶1）；流速：5.0 mL／min；进样量：5 mL；收集时间：900～1 900 s；在线浓缩至2 mL，氮气吹至近干，1 mL乙腈溶解定容，待检测。

（2）净化法2 （杜仲、金银花、山茱萸）。提取液经GPC净化，GPC净化参数同1.3.2（1），将900～1 900 s经GPC净化后的流出液氮气吹干，然后进行SPE净化过程，5 mL乙腈洗涤浓缩瓶，洗涤液合并上样，10 mL乙腈洗脱，收集全部流出液，旋转蒸发至近干，氮气吹干，1.0 mL乙腈溶解定容，待检测。

1.4 气相色谱-质谱分析条件

1.4.1 气相色谱条件

色谱柱：HP-5MS （30 m×0.25 mm，0.25 μm，美国Agilent公司）；载气：氦气（纯度不小于99.999%），流量1.0 mL／min；进样量1.0 μL，不分流进样（1 min后开启）；进样口温度：250℃；程序升温：初始温度60℃，保持2 min，以15℃／min升到150℃，再以3℃／min升到180℃，保持2 min，以5℃／min升到280℃，保持3 min；质谱连接口温度：280℃。

1.4.2 质谱条件

电子轰击离子源：EI；电离能：70 eV；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；扫描模式：选择离子监测（SIM）。

81种农药测定参数见表1。

表1 81种农药名称、保留时间、质谱参数

2 结果与讨论

2.1 提取条件

2.1.1 提取方式

中药材中农药残留的提取方法主要有超声波提取法和加速溶剂萃取法，由于加速溶剂萃取法需要专门的仪器设备，而超声波提取法对实验条件要求较低，便于应用，故本实验采用超声波提取法对中药材中的农药残留进行提取。

2.1.2 提取溶剂

分别考察乙腈、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷作为提取溶剂对中药材中农药残留的提取效果。称取4份6.00 g中药材平行样品，加入25 mL超纯水，超声浸泡30 min后分别加入15 mL乙腈、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷，振荡提取20 min，由于乙腈与水互溶，加入过饱和的氯化钠溶液，利用盐析作用使水相和有机相分离，以除去水和水溶性杂质，同时还可减少提取液中的杂质含量并提高待测组分在有机相中的分配比。结果表明，乙酸乙酯和丙酮对绝大多数农药有较大的溶解度，易将农药提取出来，但同时大量杂质也被提取出来，给净化带来困难；二氯甲烷对部分农药的提取回收率只有20%左右；乙腈回收率高，提取液杂质含量少，故采用乙腈作为提取溶剂。由于部分农药在弱酸性条件下性质稳定，因此采用含0.1%乙酸的乙腈进行提取。

最终确定的提取方法：6.00 g样品加25 mL超纯水，超声浸泡30 min后加入15 mL含0.1%乙酸的乙腈，振荡提取20 min。

2.2 净化条件

参考凝胶渗透色谱在甘草及其提取物中农药残留净化方法中的应用，对天麻、杜仲、金银花、山茱萸进行GPC净化实验，实验结果表明：天麻回收率为78.5%～120.8%，而杜仲、金银花、山茱萸可能存在基质抑制效应而回收率偏低。GPC主要去除糖、色素、油脂等大分子，杜仲、金银花、山茱萸经过GPC净化后还存在一些小分子杂质（有机酸和甾醇等），产生基质抑制效应，需要进行进一步净化，参考相关文献，选取PSA固相萃取小柱进行进一步的净化，经过GPC净化的收集液，使用氮气吹干，以5 mL乙腈溶解上样，5 mL乙腈洗涤浓缩瓶，洗涤液合并上样，5 mL乙腈洗脱，整个净化过程保持流速2～3 mL／min，收集所有流出液，旋转蒸发至近干，用氮气吹干，1.0 mL乙腈定容。

2.3 线性方程、回收率、精密度和检出限

以峰面积Y对农药质量浓度X进行线性回归，得到线性方程，以3倍信噪比计算检出限，结果见表2。

表2 81种农药标准的线性方程，相关系数和检出限

续表2

选取陕南出产具有代表性的中药材：天麻、杜 仲、金 银 花、山 茱 萸，在1，5，10 μg／kg 3个添加水平下进行加标回收试验，每个添加水平做6次平行测定，其中杜仲在添加1 μg／kg时，回收率为60.8%～128.9%，相对标准偏差（RSD）为5.9%～21.7%；添 加5 μg／kg时，回 收 率 为66.0%～127.3%，RSD为7.6%～18.9%；添 加10 μg／kg时，回 收 率 为69.0%～127.3%，RSD为7.7%～14.9%。天麻的回收率为78.5%～120.8%，RSD为7.6%～13.1%。山茱萸的回收率为71.7%～116.3%，RSD为10.3%～11.6%。金银花的回收率为72.9%～116.0%，RSD为8.7%～18.9%。

3 结语

建立了天麻、杜仲、金银花和山茱萸中81种农药残留同时检测的气相色谱－质谱法。中药材中的农药残留提取液经GPC或GPC-SPE固相萃取小柱净化后用GC-MS法测定，天麻、杜仲、金银花和山茱萸的加标回收率较高。该方法操作简单、净化效果好、灵敏度高，准确度和精密度均符合多残留分析的要求。

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