张秋龙，梁永欣，李文聪，索有瑞，丁晨旭* ，王洪论

1中国科学院西北高原生物研究所，西宁810001;2 中国科学院研究生院，北京100049;3 青海民族大学，西宁810007

藏药角茴香(Hypecoum leptocarpum Hook. f. et Thoms)为罂粟科角茴香属植物［1］，别名咽喉草、山黄连或野茴香等，藏药名为巴尔哇打、巴尔巴达。生长于海拔4.300 km 以下的草原、草甸、砂砾地上［2］，味苦性凉，清血热、温热和毒热［3］。《西藏常用中草药》称其有解热镇痛、消炎解毒之功效，可治伤风感冒、头痛、四肢关节疼痛、胆囊炎，并解食物中毒。《陕甘宁青中草药选》中称:细果角茴香能治流感、咽喉肿痛、目赤等症。现代分析化学和天然产物化学研究发现:细果角茴香中含有多种生物碱成分，如:原阿片碱、隐品碱、血根碱等［4］。但国内文献关于细果角茴香中其它化学成分如总黄酮的含量研究尚少见报道，刘永红等人［7］曾用甲醇为提取溶剂，采用正交法研究过提取工艺，本文用乙醇代替毒性较大的甲醇，采用超声波辅助提取法［5，6］，在单因素实验的基础上，使用响应面法［8，9］优化细果角茴香中总黄酮的提取工艺，为细果角茴香的进一步研究开发提供更精确的科学依据和数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

细果角茴香:采收于青海互助县北山，经中科院西北高原生物研究所中药学专家索有瑞研究员鉴定，自然风干，粉碎;芦丁，购于北京生物医药公司;其它化学试剂均为分析纯。

仪器:T6 新世纪紫外-可见分光光度计，北京谱析通用仪器有限责任公司生产;KQ-500E 型超声波清洗器(500W)，昆山市超声仪器有限公司;N-1100旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司;AL204 电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;SHZ-3 型循环水多用真空泵，上海亚荣生化仪器厂;DLSB-5/20 低温冷却循环泵，郑州长城科工贸有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芦丁标准液的配制

精确称取120 ℃干燥恒重的芦丁标样10 mg，用30%乙醇溶解并定容于50 mL 容量瓶中，摇匀，即得浓度为0.2 mg/mL 标准溶液。

1.2.2 吸收曲线绘制

准确移取芦丁标液5.00 mL，按标准曲线下的测定方法，在450～600 nm 处测定吸收光谱，在510 nm 处有最大吸收，故选择510 nm 为测定波长。

1.2.3 标准曲线绘制

分别移取芦丁标准溶液0. 00、1. 00、2. 00、3.00、4.00、5.00 mL 于25 mL 容量瓶中，用30%乙醇稀释至10 mL，加入1.0 mL5%NaNO2溶液摇匀，立刻加入1. 0 mL 10% Al(NO3)3摇匀，放置10 min。加入5 mL 1 mol/L NaOH 溶液，用30%乙醇定容，混合后摇匀，放置10 min，以试剂空白为参比，在510 nm 处测吸光度值。以芦丁的浓度C(mg/mL)为横坐标，以吸光度值A 为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线方程为:A = 10. 39C-0. 0018，r =0.9991。

1.2.4 超声提取

细果角茴香粉碎后过40 目筛，称取1 g，加60%乙醇30 mL，浸泡15 min 后，在50 ℃下超声30 min，抽滤。待样品冷却到室温再进行下一次处理。合并滤液，用旋转蒸发仪回收溶剂，浓缩后用乙醇定溶于50 mL 容量瓶中备用。实验分别考察了乙醇溶液浓度、液料比、提取温度、超声提取时间等因素对细果角茴香中总生物碱得率的影响。在单因素实验的基础上，选取乙醇浓度(A)、提取时间(B)、料液比(C)三个对总黄酮提取率影响较大的因素，对提取条件进行响应面分析，优化提取工艺条件。

1.2.5 含量测定

吸取2 mL 滤液于25 mL 容量瓶中，按照标曲下的测定方法测吸光度，计算含量、得率。

1.2.6 单因素实验

以乙醇为提取溶剂，主要考察乙醇溶液浓度、液料比、提取温度、超声提取时间等因素对细果角茴香中总生物碱得率的影响。

1.2.7 细果角茴香中总黄酮的提取工艺优化

根据Box-Behnken 中心组合实验设计原理，综合单因素实验结果，在50 ℃下以乙醇溶液为提取剂，选取对总黄酮影响较大的因素乙醇浓度(A)、提取时间(B)、液料比(C)，进行中心组合实验，并结合单因素实验条件选取合理水平。以总黄酮的得率为响应值，通过响应面分析得出超声波提取细果角茴香中总黄酮的最佳提取工艺条件和方法。实验设计因素编码及水平见表1。

表1 中心组合设计因素与水平表Table 1 Factors and levels of the central composite design

2 结果与分析

2.1 单因素对细果角茴香总黄酮得率的影响

2.1.1 乙醇溶液浓度对细果角茴香中总黄酮提取率的影响。

固定提取时间30 min，提取温度50 ℃，液料比30∶1，选择乙醇浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%按照1.1.4 进行实验。结果见图1。

图1 乙醇溶液浓度对总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

由图1 可知，在乙醇浓度60%左右提取率最大，因此选择乙醇浓度在60%左右为宜。

2.1.2 提取时间对细果角茴香中总黄酮提取率的影响

固定乙醇浓度60%，提取温度50 ℃，液料比30∶1 mL/g，选择超声时间分别为20、25、30、35、40 min，按照1.1.4 进行实验。结果见图2。

图2 超声时间对总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction yield of total flavonoids

由图2 可知，在10～30 min 内，总黄酮的提取率随着时间的延长而显著增加，30 min 以后，总黄酮得率变化不大。为了节能超声处理时间在30 min左右为宜。

2.1.3 料液比对总黄酮提取率的影响。

固定提取温度50 ℃，乙醇浓度60%，提取时间30 min，选择液料比分别为20、25、30、35、40，按照1.1.4 进行实验。结果见图3。

图3 液料比对总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of ratio of liquid to solid on extraction yield of total flavonoids

由图3 可知，当料液比达到30∶1 左右时，总黄酮基本溶出，再增加提取剂用量，提取率变化不大。因而，液料比30∶1 左右为宜。

2.1.4 温度对总黄酮提取率的影响。

固定乙醇浓度60%，提取时间30 min，液料比为30∶1，选择提取温度分别为40、50、60、70、80 ℃，按照1.1.4 进行实验。结果见图4。

图4 温度对总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of temperature on extraction yield of total flavonoids

由图4 可知，总黄酮的提取率随着温度的提高而提高。温度的升高会加强溶液中各分子的运动，促进扩散作用，有利于提高提取率，但温度过高有可能破坏黄酮的结构而降低其含量，故选择提取温度应为50 ℃。

2.2 响应面分析实验结果与数据分析

利用DesignExpert8.0.7.1 软件，通过表2 中总黄酮得率实验数据进行多元回归拟合，对实验结果进行响应面分析，得出回归模型方差分析表和响应曲面图，分别见表3 和图5。

表2 Box-Behnken 中心组合设计方案及实验结果Table 2 Box-Behnken experiments design and the results of these experiments

120001.179 131011.409 140001.498 15-1-101.450 160001.363 171101.457

表3 拟合二次多项式模型的方差分析Table 3 Analysis of variance(ANOVA)for the fitted quadratic polynomial model

图5 各两因素交互作用对总生物碱提取率影响的响应面图Fig.5 Response surface plots of mutual influences of extraction conditions on the extraction yields of total flavonoids

通过拟合可求出影响因素的一次效应、二次效应及其交互效应的关联方程，多元回归拟合分析得到细果角茴香总黄酮提取率Y 与各因素变量(A 乙醇浓度，B 提取时间，C 液料比)的二次方程模型为:Y = 1. 48-0. 024 × A + 0. 050 × B + 0. 13 × C +5.500E-003 ×A×B+ 4.500E-00 ×A ×C-0.036 ×B×C-0.055 ×A2-0.015 ×B2-0.081 ×C2

从表3 中方差分析结果可知方程一次项、二次项的影响均极显著，说明分析结果可靠;从试验所得的响应面分析结果可以找到它们在提取过程中的交互作用，如表3 和图5 可知提取时间和液料比之间的交互作用显著，其余项间的交互作用不明显。根据Design Expert 8.0.7.1 软件对实验结果进行最优化分析，确定最佳的提取条件为:乙醇浓度58%，提取时间34.55 min，液料比32.95 mL/g，在此条件下预测总黄酮的得率为1.538%。

2.3 验证实验

根据模型预测结果进行近似验证实验，但考虑到实际操作的便利，将最佳工艺条件修正为乙醇浓度58%，提取时间34.50 min，液料比33 mL/g，在此条件下总黄酮提取率为1.525%(n=3)。

3 结论

用超声法提取细果角茴香中总黄酮，根据单因素实验结果，采用Box-Behnken 试验设计以及响应面分析对提取工艺进行优化，得出最优工艺条件为:乙醇浓度58%，提取时间34.50 min，液料比33 mL/g。在此工艺条件下，总黄酮提取率为1.525%(n =3)。该研究结果对细果角茴香中总黄酮的提取研究提供一定的参考价值，具有一定的实际应用前景。

1 Northwest Institute of Plateau Biology，Chinese Academy of Sciences(中国科学院西北高原生物研究所). Flora Qinghaiica(青海植物志)，Vol 1.Xining:Qinghai People’s Publishing House，1997.393.

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