陈 强，王立成，费东亮，苏禹刚

布鲁氏菌病（Brucella）流行范围广，危害大，不仅威胁人、家畜及野生动物的健康［1］，还严重影响了乳、肉及其制品等。在中国流行的主要是牛、羊、猪3种布鲁氏菌病［2］。全世界有3.5亿的人受到本病的威胁［3］。分离到锦州地区的布鲁氏菌菌株，有利于了解它在本地的流行特点，对保障本地人畜的生命安全有着重要的意义。本试验在对锦州地区两家奶牛场布鲁氏菌血清学检测的基础上，采集阳性牛的全血和奶样进行了布鲁氏菌的分离和纯培养。

1 材料与方法

1.1 样品

奶牛场的血清126份，全血15份和奶样71份。

1.2 培养基、试剂及仪器

布鲁氏菌病试管凝集抗原；标准阴、阳性血清；革兰氏染色液；液体培养基等；奥林巴斯显微镜。以上用品全部由辽宁医学院畜牧兽医学院实验中心提供。

1.3 试管凝集试验（SAT）检测方法与步骤

第1～4管分别加入稀释液1.2mL、0.5mL、0.5mL、0.5mL，然后吸取奶牛血清0.05mL，加入第1管内，充分混匀后弃去0.25mL。吸0.5mL第1管内液体加入第2管，混匀，再吸第2管内液体0.5 mL到第3管，再吸第3管内液体0.5mL到第4管，最后第4管弃去0.5mL液体。将0.5mL20倍稀释的抗原加入管中，并振摇均匀，置37℃温箱24 h，取出检查并记录结果。每次试验均应设阴、阳性血清和抗原对照。

1.4 细菌分离培养

1.4.1 细菌分离 将奶样充分摇匀，无菌条件下在选择性培养基上均匀涂布。平皿放于37℃5%CO2温箱，每天注意菌落生长，详细记下菌落数量等。

将全血充分摇匀，无菌条件下移0.2mL至双相培养基中，注意混匀，放于37℃5%CO2温箱，每天注意菌落生长，详细记下菌落数量等。

1.4.2 细菌纯培养 用接种环挑取平皿上的单菌落，交叉划线接种于固体和液体培养基，放于37℃5%CO2温箱，观察纯培养细菌的生长特性。

1.5 革兰氏染色法鉴定

涂片固定→草酸铵结晶紫染1min→自来水冲洗→加碘液覆盖涂面染约1min→水洗，用吸水纸吸去水分→加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20s后水洗，吸去水分→蕃红染色液（稀）染2min后，自来水冲洗。干燥，镜检［4］。

2 结果与分析

2.1 试管凝集试验（SAT）检测结果

见表1，从表1中得知，牛场1和牛场2奶牛布鲁氏菌检测阳性率分别为31.6%、27.4%。

表1 试管凝集试验（SAT）检测结果

2.2 细菌分离培养结果

从两牛场所采集的71份奶样分离培养共获得7株细菌。培养基上观察到透明、边缘整齐、隆起的露珠状菌落。

2.3 革兰氏染色结果

革兰氏染色法染色7株菌全部被染成红色、短棒状。

3 讨论

由于布鲁氏菌生长缓慢、对营养的要求高［5］，再加上奶样中可能混有其他细菌，而这些细菌易于生长，所以就影响了布鲁氏菌的分离率。本试验结果表明，从71分奶样中共分离得到7株布鲁氏菌。

4 结论

对锦州地区两家奶牛场的126头奶牛进行布病检测，对71只阳性牛只采集病料分菌，分离纯化菌株7株，均为布鲁氏菌，应当引起足够重视。

［1］白文彬，于康震主编.动物传染病诊断学［M］.中国农业出版社，2002.621－627.

［2］毛开荣.动物布鲁氏茵病防治研究进展［J］.中国兽药杂志，2003，37（9）：39－40.

［3］尚德秋.布氏菌病研究进展［J］.中国地方病防治杂志，2004，19（4）：204－212.

［4］蔡一非，范伟兴，伊日盖.两奶牛场布氏杆菌分离鉴定及四种血清学检测方法比较［J］.中国人兽共患病学报，2009，24（4）：40－42.

［5］雷连成.布鲁氏菌鉴定和检测方法研究进展［J］.动物医学进展，2002，33（2）：22－24.