肖 浩，郑小江

(1.湖北省恩施州农业科学院，湖北 恩施 445000; 2.湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000)

响应面法优化发酵藤茶黄酮和多糖的提取工艺

肖 浩1,2，郑小江2*

(1.湖北省恩施州农业科学院，湖北 恩施 445000; 2.湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000)

根据单因素试验的结果，采用响应面分析法优化藤茶黄酮和多糖的提取工艺.结果表明：最佳提取工艺条件为提取温度96℃，时间1.6 h，料液比1∶21.在此优化工艺条件下，总黄酮和多糖的提取得率分别为22.94%和2.13%.藤茶黄酮和多糖的优化提取工艺有利于藤茶资源的综合开发利用.

发酵藤茶；黄酮；多糖；响应面；优化提取

藤茶为葡萄科(Vitaceae)蛇葡萄属(AmpelopsisMichaux)显齿蛇葡萄，学名为Ampelopsisgrossedentata(Hand-Mazz) W.T. Wang，是一种野生木质攀援藤本植物，俗称山甜茶、白茶、甘露茶、白毛猴、龙须茶、茅岩莓茶等，主要分布于我国长江流域的湖南、湖北、云南、贵州、广东、广西、福建等地[1-4].研究表明，藤茶中含有黄酮、多糖、多酚、蛋白质、氨基酸等多种活性成分，其中最主要的活性成分是以二氢杨梅素为主的黄酮类物质[5-7].经大量药理学试验证明，二氢杨梅素具有消炎镇痛、祛痰止咳、降血脂、抗氧化、保肝护肝、增强免疫力、抗癌等药理功效[8-16].同时藤茶多糖也具有抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力等功能，具有较高的开发利用价值[17-19].近年来，已有许多学者开展了从藤茶中提取黄酮和多糖的研究，通常是以有机溶剂提取藤茶黄酮，如乙醇、甲醇等[20].这种方法提取成本高，回收溶剂的能耗高，还存在费时、重现性差、对设备要求高等不足之处.而且所用溶剂通常有毒或易燃易爆，易对环境和操作人员造成危害.超临界萃取藤茶黄酮虽具有节省试剂，无污染等优点，但为了获得超临界条件，设备一次性投资较大，运行成本高，回收率较差.此外，还有大孔树脂吸附法、微波萃取法、逆流法、超声波辅助溶剂提取法等[21-22]，均存在投资成本高、操作复杂等缺点.本课题组通过对藤茶黄酮的研究发现，二氢杨梅素其中的主要成分，在热水和冷水中的溶解度差别很大，因此可用热水作为提取剂.同时，用热水提取还可以增加藤茶多糖的溶出，同时得到黄酮和多糖，具有其他方法无法比拟的优势.本文以发酵型藤茶加工后的边角料为试验材料，采用热水浸提法，优化提取藤茶中的黄酮和多糖，然后分离纯化，得到黄酮和多糖两类活性成分.该方法工艺简单，成本低，提取得率较高，环保，适合工业化连续生产，可为藤茶有效成分的综合开发利用提供技术支持.

1 材料与设备

1.1 试验材料

“白露”发酵型藤茶加工后的边角料，于60℃鼓风干燥箱中烘干，粉碎，过60目筛，石油醚脱脂，保存备用.

1.2 主要仪器与设备

2 试验方法

2.1 浸提指标测定方法

2.1.1 总黄酮含量测定 标准曲线[23]：称取二氢杨梅素对照品5 mg，置于50 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至50 mL，配制成100 μg/mL的溶液.吸取上述标准溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mL，分别置于10 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，在292 nm下测定吸收度，以对照品的浓度为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得标准曲线方程y=0.038 3x+0.009 1，R2=0.999 3.样品测定方法同标准曲线.

2.1.2 多糖含量测定 标准曲线[24]：精密称定干燥至恒重的葡萄糖对照品10 mg，用蒸馏水溶解并定容至100 mL容量瓶中，配成0.1 mg/mL的标准溶液.分别吸取标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL置10 mL具塞试管中，各加入蒸馏水补充至1 mL，加入0.2%硫酸-蒽酮试液4 mL摇匀，浸于冰水浴中冷却，然后移至沸水浴中加热10 min，取出用冷水冷却至室温，室温放置10 min左右，于620 nm处测定吸光度，得标准曲线方程y=0.031 7x-0.001 2，R2=0.999 3.样品测定方法同标准曲线.

2.2 单因素试验

准确称取经石油醚脱脂的藤茶叶粗粉1.0 g，加入一定量去离子水，在一定温度下于水浴锅内提取一定时间，离心，将提取液用水定容至25 mL.然后从中分别取0.2 mL参与反应，测定其中的黄酮含量.另外从中取5 mL于离心管中，加入4倍体积的无水乙醇，静置过夜，离心，将沉淀用水溶解并定容至100 mL，从中取1 mL溶液参与反应，测定其中的多糖含量.以不同的浸提温度(55、65、75、85、95℃)、浸提时间(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)为单因素，考察各单因素对藤茶总黄酮和多糖提取得率的影响.

2.3 响应面分析

根据单因素试验结果，采用Box-behnken设计试验方法对浸提温度、浸提时间、料液比3个因素(分别以A、B、C代码表示)的低、中、高三个试验水平分别以-1、0、1进行因素编码，通过响应面分析法对提取条件进行优化.

UAV+RFID技术的三维路径规划模型如图1所示，图中以网格形式标注出了UAV的空间任务、空间障碍物和RFID的感应区域。

3 结果与讨论

3.1 单因素浸提效果分析

3.1.1 浸提温度对提取率的影响 设定料液比1∶20，提取时间为2 h，提取1次(下同)，不同浸提温度下的总黄酮和多糖提取得率如图1所示.随着提取温度的升高，总黄酮和多糖的提取得率逐渐增加.因提取的温度越高，溶出的杂质也越多，且85℃以上的高温对藤茶黄酮的结构和活性有一定的影响，综合考虑提取成本及黄酮成分的稳定性，选择85℃为最合适提取温度.

3.1.2 浸提时间对提取率的影响 设定料液比1∶20，提取温度为85℃，不同浸提时间下的总黄酮和多糖提取得率如图2所示.随着浸提时间的延长而总黄酮与多糖含量增加，但增加的幅度不大.当浸提时间达到2.5 h后，虽然多糖提取得率增大，但黄酮提取得率开始下降，可能是提取时间的延长增加了杂质的溶出量，或者是黄酮成分结构发生了变化.另外，提取时间的延长降低了生产的效率.综合考虑，选择2.5 h为最佳的提取时间.

图1 提取温度对总黄酮与多糖提取得率的影响 图2 提取时间对总黄酮与多糖提取得率的影响

图3 液料比对总黄酮与多糖提取得率的影响Fig.3 The effect of solid-liquid ratio on the extraction rates of total flavonoids and polysaccharides

方差来源平方和自由度均方F值P值显著性Model7．1090．7918．640．0025∗∗A0．09010．0902．140．2038B0．2210．225．230．0710C4．9314．93116．560．0001∗∗AB0．4110．419．680．0265∗AC0．1410．143．320．1278BC0．7010．7016．480．0097∗∗A20．3410．348．120．0358∗B20．02110．0210．490．5147C20．3110．317．220．0435∗残差0．2150．042失拟项0．1730．0552．410．3066纯误差0．04620．023总和7．3114相关系数0．9711校正决定系数0．9190变异系数0．92

3.1.3 液料比对提取率的影响 设定提取温度为85℃，提取时间为2.5 h，不同液料比下总黄酮和多糖提取得率如图3所示.从图2-3可以看出，随着液料比的增加，总黄酮和多糖提取得率明显升高，在液料比为20∶1时达到最大值，随后开始下降，故选择20∶1为最佳的液料比.

3.2响应面试验结果分析

3.2.1 设计方案和结果 根据Box-behnken的中心组合实验设计原理，综合单因素实验结果，试验设计方案和结果如表1、表2，方差分析如表3、表4.

表1 Box-behnken试验因素水平及编码

Tab.1 Factors,levels and codes for Box-behnken design

因素与水平温度A/℃时间B/h料液比C-1752．01∶150852．51∶201953．01∶25

表2 Box-behnken设计方案与试验结果

表4 方差分析表—多糖提取得率

由表3可以看出，影响总黄酮提取得率的主次因素顺序为：料液比>时间>温度.其中C为极显著影响因素，交互项BC达到极显著水平，AB达到显著水平，平方项A2、C2达到显著水平.藤茶总黄酮提取得率的回归方程：Y1=22.69+0.11A+0.17B+0.79C-0.32AB-0.19AC+0.42BC-0.3A2-0.075B2-0.29C2.经分析得，在A=1.05，B=-1.75和C=0.21时，即提取温度为95.5℃，提取时间为1.63h和料液比为1:21.05为藤茶总黄酮提取的最佳工艺条件，在此最佳的提取条件下，总黄酮与多糖提取得率预测值分别为22.49%和2.03%.

图4给出了当温度、时间、料液比其中一个选取固定值时，其他两因素及其交互作用对藤茶黄酮提取得率影响的响应曲面及等高线图.

等高线的形状可以反映出交互效应的强弱，椭圆形表示交互效应显著，而圆形与之相反.从图4可以看出，提取温度和时间的交互作用显著，提取时间与料液比的交互作用显著，对藤茶黄酮提取得率有较大影响.

由表4可以看出，影响多糖提取得率的主次因素顺序为：温度>时间>料液比.其中A为极显著影响因素，交互项AC达到极显著水平，平方项A2达到极显著水平.藤茶多糖提取得率的回归方程：Y2=1.62+0.21A+0.046B+0.01AB+0.11AC+0.027BC+0.15A2+0.036B2.

经分析得，在A=-0.016，B=0.065，C=-1.87，即提取温度为84.84℃，提取时间为2.53 h，料液比为1∶10.65为提取藤茶多糖的最佳工艺条件，在此优化提取工艺条件下，多糖与总黄酮提取得率预测值分别为1.62%和20.15%.

a料液比=1∶21.05

b时间=1.63 h

c温度=95.5℃图4 试验因素及其交互作用对藤茶黄酮提取得率影响的响应曲面及等高线图Fig.4 Response surface and contour plots for the effects of cross-interactions among factors on extraction rate of total flavonoids

图5给出了当温度、时间、料液比其中一个选取固定值时，其他两因素及其交互作用对藤茶多糖提取得率影响的响应曲面及等高线图.

a料液比=1∶10.55

b时间=1.53 h

c温度=84.84℃图5 试验因素及其交互作用对藤茶多糖提取得率影响的响应曲面及等高线图Fig.5 Response surface and contour plots for the effects of cross-interactions among factors on extraction rate of polysaccharides

由图5可以看出，提取温度和料液比的交互作用显著，提取时间与料液比的交互作用显著，对藤茶多糖提取得率有较大影响.

综合以上分析，采用提取总黄酮的最佳工艺对黄酮和多糖的提取得率均较高，可作为两者同时提取的最佳工艺.由此确定，藤茶总黄酮和多糖的最佳提取工艺条件为：浸提温度95.5℃，提取时间1.63 h和料液比1∶21.05.

3.2.2 验证试验 结合模型预测的最佳提取工艺条件，根据实际情况调整提取温度为96℃，时间为1.6 h，料液比为1∶21，按此工艺进行验证试验，结果总黄酮与多糖提取得率分别为22.94%和2.13%，验证试验结果与预测值接近，进一步验证了模型与试验结果的可靠性.从结果可以看出，从藤茶中提取得到总黄酮多糖提取得率比文献报道的偏低，这可能与使用的材料有关系.本试验所用的材料为藤茶叶加工成商品后的边角料，其中含有较多的杂质.

4 结论

应用响应面分析法优化的藤茶黄酮和多糖的综合提取工艺条件为：浸提温度95.5℃，时间1.63 h，料液比1∶21.05.根据实际情况调整提取温度为96℃，时间为1.6 h，料液比为1∶21.按此模型进行验证试验，其结果为总黄酮提取得率为22.94%，多糖提取得率为2.13%.

从本试验的结论可以看出，藤茶加工后的下脚料中还含有较多的黄酮和多糖，可作为一种开发天然产物的资源加以充分利用，以减少资源浪费，同时也能提高藤茶的综合经济价值.

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OptimizationofExtractionProcessforFlavonoidsandPolysaccharidesfromFermentedAmpelopsisgrossedentata

XIAO Hao1，2,ZHENG Xiao-jiang2*

(1.Academy of Agricultural Sciences of Enshi Tujia and Miao Autonomous Prefecture,Enshi 445000,China； 2.School of Biological Science and Technology,Hubei University for Nationalities,Enshi 445000,China)

On the basis of single-factor tests, response surface analysis (RSA) was used to optimize the extraction process of flavonoids and polysaccharides from fermentedAmpelopsisgrossedentata. The optimal conditions were as follows:extraction temperature was 96℃, extraction time was 1.6 h and solid-liquid ratio was 1∶21.Under these optimal conditions, the extraction rates of total flavonoids and polysaccharides were 22.49% and 2.03%,respectively.This optimal extraction process for total flavonoids and polysaccharides from fermentedAmpelopsisgrossedentatawill benefit the comprehensive development and utilization ofAmpelopsisgrossedentata.

fermentedAmpelopsisgrossedentata; flavonoids; polysaccharides; response surface analysis; optimal extraction

2013-04-04.

湖北省自然科学基金创新群体项目(2009CDA115)；湖北省研究与开发计划项目(2011BBB061).

肖浩(1986- )，男，硕士研究生，主要从事野生植物资源保护与利用的研究；*

：郑小江(1958- )，男，教授，硕士生导师，主要从事野生植物资源保护与利用.

Q539

A

1008-8423(2013)02-0132-06