李忠亮，张治然，袭荣刚（解放军第210医院药学部，辽宁大连 116021）

苯扎贝特（Bezafibrate）是氯贝丁酸衍生物类血脂调节药，能够降低升高了的血清甘油三酯、总胆固醇以及极低密度脂蛋白-胆固醇的水平，从而使高脂血症患者的脂质正常化。其作用机制有2个方面：（1）抑制羟甲基戊二酸单酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶而减少胆固醇的合成；（2）增加脂蛋白酯酶和肝酯酶的活性而加快甘油三酯的清除以及增加高密度脂蛋白-胆固醇的水平。本药还可以轻度降低血糖，适用于糖尿病伴高脂血症患者。国内关于苯扎贝特在健康人体内的药动学研究数据并不充分，本试验开展苯扎贝特在不同性别健康人体内的药动学研究，从而为临床合理应用提供数据参考。

1 材料

1.1 仪器

LC-10 ATvp高压液相色谱仪，包括Sil-10 ADvp自动进样器、SPD-10 Avp紫外检测器、Class-VP色谱工作站（日本岛津公司）；TGL-16 M台式高速冷冻离心机（湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司）；XW-80 A微型涡旋混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）；TG328 A型分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；Delta 320型精密pH计（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；MTN-2800 W氮吹浓缩装置（天津奥特塞恩斯仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

苯扎贝特片（阿贝他，江苏天力士贝特制药有限公司，规格：每片200mg，批号：06050103）；苯扎贝特对照品（批号：100627-200801，纯度：98.0%，0.98 mg/1 mg）、格列吡嗪（内标，批号：100285-200604，纯度：99.9%，0.999mg/1mg）均由中国食品药品检定研究院提供；甲醇为色谱纯，冰乙酸、正己烷、无水乙醚、无水乙酸钠、四丁基溴化铵均为分析纯；水为二次蒸馏水；空白人血浆由解放军第210医院输血科提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.01 mol/L乙酸钠缓冲液（用冰乙酸调pH为4.0）-0.5 mol/L四丁基溴化铵（65∶35∶0.2，V/V/V）；流速：1.2 ml/min；紫外检测波长：232 nm；柱温：30℃；进样量：20 μl。在此色谱条件下，药物、血浆中内源性杂质和内标分离完全，峰形良好，其色谱图见图1。内标格列吡嗪的保留时间约为7.2 min，苯扎贝特的保留时间约为10.5 min，分离度＞1.5。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 受试者选择

选择健康志愿者20名，其中男、女各10名，年龄为（26.4±1.3）岁，体质量为（55.8±5.5）kg，身高为（168.3±2.6）cm。体格检查示肝、肾功能无异常，不吸烟、不嗜酒。女性健康志愿者受试时间避开月经、妊娠及哺乳期。试验前2周内未服用任何其他药物。受试者均签署知情同意书。临床试验方案经解放军第210医院医学伦理委员会批准。

2.3 试验方案

试验采用单剂量给药。受试者于试验前1日晚餐后，开始禁食不禁水；于试验日晨空腹口服给药400 mg，以温开水200 ml吞服，服药2h后，可自由饮水；4h后，进统一清淡低脂饮食。服药期间禁烟、酒和含咖啡因类饮料，避免剧烈运动和长时间卧床。

2.4 血样采集

受试者于服药前（0h）和服药后的0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h时于肘静脉取血5 ml，置肝素化试管中，3.5×103r/min离心（离心半径为15 cm）10 min，分离血浆，置－70℃冰箱保存待测。

2.5 样品预处理

精密量取血浆200 μl，置10 ml离心管中，加入甲酸 40 μl，加入内标溶液（25 μg/ml格列吡嗪）40 μl，加入1 mol/L盐酸 50 μl，涡旋1 min，加入乙醚-正己烷（2∶1）提取液2 ml，振荡混合2 min，4×103r/min离心（离心半径为15 cm）10 min，取有机层，置5ml离心管中，于37℃水浴中氮气流吹干，残渣用流动相300 μl溶解，涡旋1 min，移至1.5 ml离心管中，1.5×104r/min离心（离心半径为15 cm）5 min，取上清液20 μl进样分析。

2.6 标准溶液的配制

准确称取苯扎贝特对照品102.4 mg，置1000 ml量瓶中，用甲醇溶解定容，制成100.0 μg/ml苯扎贝特贮备液。精密量取0.5、1.5、5.0、12.5、25.0、50.0、100.0ml置100ml量瓶中，用甲醇定容，即得0.5、1.5、5.0、12.5、25.0、50.0、100.0 μg/ml系列质量浓度标准溶液。另准确称取格列吡嗪对照品25.0 mg，置1000 ml量瓶中，用甲醇溶解定容，制成25 μg/ml格列吡嗪内标溶液。

2.7 标准曲线的制备

精密量取空白血浆200 μl，置10 ml离心管中，分别精密加入上述苯扎贝特系列标准溶液各40 μl，制成血浆中含苯扎贝特为0.1、0.3、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μg/ml的血浆样品，按“2.5”项下方法处理血浆样品，进行色谱分析，记录色谱。以苯扎贝特的峰面积与内标峰面积比（R）对浓度（c）进行线性回归，得血浆标准曲线方程：R＝0.27548 c－0.12549（r＝0.9993），结果表明，苯扎贝特血药浓度在0.1～20.0 μg/ml范围内线性关系良好。本法测定血浆中苯扎贝特的定量下限为0.1 μg/ml。

2.8 精密度及回收率试验

按“2.7”项下方法配制苯扎贝特低、中、高（0.250、2.038、13.333 μg/ml）3个质量浓度的血浆样品，按“2.5”项下方法处理后进行色谱分析，将所得的药物峰面积与内标峰面积的比值代入标准曲线方程，计算方法回收率。将测定值与相应浓度对照品溶液直接进样所得结果比较，计算提取回收率。取上述各浓度血样于同一天内分别测定5次，连测5 d，计算日内和日间RSD。精密度及回收率试验结果见表1。

表1 精密度及回收率试验结果（n＝5）Tab 1 Results of precision and recovery tests（n＝5）

2.9 稳定性试验

同“2.8”项下方法配制低、中、高3个质量浓度血浆样品，每个浓度3份。1份按“2.5”项下方法操作，在室温放置24 h，考察血浆样品在室温条件下的稳定性；1份于－70℃冰箱冷冻，反复冻融3次，按“2.5”项下操作，考察血浆样品经反复冻融的稳定性；1份于－70℃冷冻保存1个月，按“2.5”项下操作，考察血浆样品在长期冷冻条件下的稳定性。结果显示RSD均＜10%（n＝3），表明苯扎贝特在室温、反复冻融以及长期冷冻条件下稳定性均较好。

2.10 药动学参数

20名健康志愿者单剂量口服苯扎贝特片400 mg后，苯扎贝特平均药-时曲线见图2。用DAS 2.1程序软件进行处理，以赤池信息量准则（AIC）值作为模型识别指标，结果符合二室开放模型。

图2 健康志愿者单剂量口服400mg苯扎贝特片后平均药-时曲线（±s ，n＝10）Fig 2 Mean plasma concentration-time curves of Bezafibrate tablets 400 mg in healthy volunteers after oral single dose（±s ，n＝10）

2.11 不同性别受试者药动学参数的比较

不同性别健康志愿者单剂量口服苯扎贝特片400 mg的药动学参数见表2。采用梯形法计算AUC0-12h值，tmax和cmax均为实测值。主要药动学参数经对数转换后采用SPSS软件进行统计分析，比较不同性别受试者的药动学参数，结果cmax、t1/2等差异均无显著性（P＞0.05）。

表2 健康志愿者单剂量口服400mg苯扎贝特片后主要药动学参数（±s， n＝20）Tab 3 Main pharmacokinetic parameters of Bezafibrate tablets 400 mg in healthy volunteers after oral single dose（±s ，n＝20）

表2 健康志愿者单剂量口服400mg苯扎贝特片后主要药动学参数（±s， n＝20）Tab 3 Main pharmacokinetic parameters of Bezafibrate tablets 400 mg in healthy volunteers after oral single dose（±s ，n＝20）

药动学参数t1/2，h cmax，μg/ml tmax，h Vd/F，L/k g CL/F，L/（h·k g）A U C0-12h，μg·h/ml A U C0-∞，μg·h/ml男性2.06±0.3311.41±3.241.93±0.290.25±0.067.73±0.4135.46±9.2640.34±10.35女性2.03±0.2711.06±3.062.07±0.380.23±0.047.52±0.2839.36±9.6339.57±9.28平均数值2.05±0.3111.24±3.152.02±0.360.24±0.057.68±0.3137.54±9.4539.46±9.82

2.12 安全性评价

20名健康受试者中，未发生明显不良反应，说明受试者在试验期间对单次口服苯扎贝特片耐受良好。

3 讨论

参照文献[1-3]，生物样品的提取回收率一般较低，本试验考查了苯扎贝特的多种提取方法，比如高氯酸等蛋白沉淀剂等，最终选择乙醚-正己烷（2∶1）为提取液，较好地保证了苯扎贝特有较高的提取回收率。最终确立的色谱检测条件和血浆提取方法操作简便快速、准确性高、专一性强、成本低、检测灵敏度理想、回收率高、最低定量下限为0.1 μg/ml，适合苯扎贝特的人体药动学研究。

参照文献[1，4]，苯扎贝特在碱性条件下非常容易发生降解，在氧化和酸性条件下也会发生降解。经筛选，采用甲醇-0.01 mol/L乙酸钠缓冲液（用冰乙酸调pH为4.0）-0.5 mol/L四丁基溴化铵（65∶35∶0.2，V/V/V）作为本次试验的流动相，可以有效地抑制苯扎贝特解离，同时又保证苯扎贝特与内标和血浆内源物的分离度符合要求，减少色谱峰拖尾。

20名健康志愿者单剂量口服400 mg苯扎贝特片后，血药浓度经DAS程序软件进行处理，以AIC值作为模型识别指标，结果符合二室开放模型；药动学参数与国内外文献报道基本相符，性别因素对本品药动学无明显影响（P＞0.05）。

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[3]谭力，钱峰，张杰，等.国产苯扎贝特片人体相对生物利用度的研究[J].中国临床药理学杂志，2000，16（4）：292.

[4]黄春森，黄东.苯扎贝特样品的稳定性探讨[J].中国医疗前沿，2008，3（21）：103.