王海燕， 邹正渝， 段 亮， 陈 娴， 李 欢， 袁世梅， 何通川， 周 兰

(重庆医科大学检验医学院临床检验诊断学教育部重点实验室，重庆400016)

骨肉瘤是最常见的原发性恶性肿瘤之一，发病年龄多在15～25岁之间，恶性程度较高，极易出现转移，预后极差，其发病原因和发病机制尚未完全清楚。目前骨肉瘤的治疗采取以手术为主的综合治疗，截肢后3～5年的存活率仅为5% ～20%左右。因此，研究骨肉瘤的发病机制，为临床早期诊断、治疗以及预后提供可靠依据。

S100A6属于S100蛋白家族成员，分子量约为10 kD，能与游离钙离子或者靶蛋白结合后发挥多种生物学作用，如参与细胞的增殖与凋亡、调节酶活性、维持胞内钙稳态，蛋白质的磷酸化等。大量文献报道其在骨肉瘤［1］、胃癌［2］等肿瘤组织中表达异常，其作用机制尚未完全明确。本课题组前期成功制备了有活性的重组人S100A6蛋白(recombinant human S100A6，rhS100A6)，外 源 性 地 加 入 30 mg/L rhS100A6能够显著增强人骨肉瘤细胞143B的增殖、迁移及侵袭能力，并且明显上调143B细胞中β-catenin的水平，而对143B细胞的凋亡没有明显影响［3］。

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信号途径是近年来发现的一条重要的细胞信号转导途径，参与细胞生长、增殖、分化等多个过程，在肿瘤的发生、发展中发挥着重要作用。LY294002和wortmannin是PI3K抑制剂，可以通透细胞特异性阻断PI3K/Akt信号通路，抑制Akt磷酸化。S100A6对143B细胞是否可以通过调节PI3K/Akt信号途径发挥作用，目前尚未报道。本课题联合rhS100A6与PI3K抑制剂LY294002或wortmannin处理143B细胞，旨在探讨PI3K/Akt信号途径在S100A6诱导的143B细胞的增殖和迁移中的作用。

材料和方法

1 细胞与试剂

人骨肉瘤细胞143B由美国芝加哥大学医学中心分子肿瘤研究室馈赠。DMEM培养基、胎牛血清购自HyClone。重组质粒 pGST-HRV3C、pGST-ClvHRV3C-hS100A6和感受态细菌E．coli BL21为本实验室保存。LY294002购自CST。Wortmannin购自Sigma。鼠抗人S100A6单克隆抗体、鼠抗人β-actin单克隆抗体购自Santa Cruz。兔抗人Akt多克隆抗体、兔抗人p-Akt(Ser473)多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体购自CST。化学发光试剂盒购自Pierce。PVDF膜和Millicell细胞培养小室购自Millipore。MTT购自Sigma。结晶紫购自温州东升化工公司。

2 方法

2．1 rhS100A6的制备 rhS100A6制备的方法参考文献［3］。分别将重组质粒 pGST-HRV3C和 pGSTClvHRV3C-hS100A6转化至感受态细菌E．coli BL21中，在LB培养基中培养扩增，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)诱导表达蛋白，分别表达重组蛋白谷胱甘肽S转移酶－人鼻病毒3C蛋白酶(glutathione S transferase-human rhinovirus 3C protease，GST-HRV3C)和重组蛋白谷胱甘肽S转移酶－人鼻病毒3C蛋白酶酶切序列-hS100A6(glutathione S transferase-human rhinovirus 3C protease cleavage site-hS100A6，GST-ClvHRV3C-hS100A6)，超声破菌后，谷胱甘肽－琼脂糖4B球珠(glutathione sepharose 4B，GS4B)纯化，GST-HRV3C酶切GST-ClvHRV3C-hS100A6，经GS4B纯化，即为rhS100A6蛋白，行SDS-PAGE(考马斯亮蓝染色)和Western blotting鉴定，－20℃保存备用。

2．2 细胞培养和分组 人骨肉瘤细胞143B培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，实验分组为:空白组、rhS100A6(30 mg/L)组、rhS100A6(30 mg/L)+LY294002(10 μmol/L)组、rhS100A6(30 mg/L)+wortmannin(0.5 μmol/L)组、LY294002(10 μmol/L)组和wortmannin(0.5μmol/L)组。

2．3 Western blotting检测细胞中 t-Akt和 p-Akt的蛋白水平 取对数生长期细胞，待细胞融合度达到50%左右时更换为1%胎牛血清DMEM培养基，进行实验干预，分组同上，于37℃、5%CO2培养箱中培养，此时记为0 h。48 h后加入细胞裂解液后提取细胞总蛋白，分光光度仪测定其浓度。蛋白煮沸变性，经10%SDS-PAGE电泳后，转移至PVDF膜，5%BSA封闭2 h，加Ⅰ抗(1∶1 000稀释)4℃孵育过夜，0.1%TBST洗涤，加Ⅱ抗(1∶5 000稀释)37℃ 孵育1 h，0.1%TBST洗涤，按照电化学发光试剂盒说明对其显色，用凝胶成像仪与Quantity One软件采集图像，并对其分析。

2．4 MTT检测细胞增殖 取对数生长期细胞，用DMEM完全培养基稀释至约1×107cells/L，于96孔板中每孔接种200μL，于37℃、5%CO2培养箱培养。12 h后更换为1%胎牛血清DMEM培养基，进行实验干预，分组同上，均设5个复孔，此时记为0 h。于1～4 d后每孔内加入20μL MTT，继续孵育4 h，弃上清，每孔加200μL DMSO，测492 nm处吸光度值，以均值为纵坐标，时间为横坐标，描绘细胞生长曲线。

2．5 Transwell检测细胞迁移 取对数生长期细胞，用无血清 DMEM培养基稀释至1×108cells/L，取400μL加入到Transwell上室内，下室加入600μL 20%胎牛血清DMEM培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养，此时记为0 h。24 h后将小室取出，PBS洗净，置于无水乙醇中固定20 min，于结晶紫中染色20 min，PBS洗净，待小室风干，倒置显微镜下观察并对各组穿膜细胞进行计数。

3 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用t检验比较两组间差异的显著性，用SPSS 16.0软件包分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 制备的rhS100A6通过鉴定并具有促进143B细胞增殖和迁移的活性

将rhS100A6经SDS-PAGE后考马斯亮蓝染色，Western blotting加以鉴定，结果显示，制备的rhS100A6分子量正确，见图1A;相比PBS阴性对照组，制备的rhS100A6蛋白能与鼠抗人S100A6单克隆抗体发生特异反应，见图1B;证实rhS100A6蛋白成功制备。

Figure 1．Identification of rhS100A6．A:SDS-PAGE;B:Western blotting．图1 rhS100A6的鉴定

随之，30 mg/L rhS100A6处理143B细胞特定时间后，MTT增殖实验和 Transwell迁移实验显示rhS100A6显著增强143B细胞的增殖(见图4 rhS100A6 group)和迁移能力(见图 5 rhS100A6 group)，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

2 rhS100A6促进143B细胞中Akt的磷酸化

30 mg/L rhS100A6作用143B细胞48 h后，Western blotting结果显示，空白组p-Akt的校正灰度值为0.35±0.03，rhS100A6组p-Akt的校正灰度值为0.67±0.02，rhS100A6组较空白组增加91.4%(P＜0.05)，而两组的t-Akt校正灰度值之间则无明显差异(P＞0.05)，见图2。结果提示rhS100A6能够促进Akt的磷酸化，即激活PI3K/Akt信号通路。

3 LY294002和wortmannin均能够部分逆转rhS100A6诱导的143B细胞中磷酸化Akt的上调

联合rhS100A6和PI3K抑制剂LY294002或wortmannin处理143B细胞48 h后，Western blotting结果显示，空白组 p-Akt的校正灰度值为0.38±0.02，rhS100A6组 p-Akt的校正灰度值为 0.96±0.05，rhS100A6组较空白组增加 263.1%(P＜0.05);rhS100A6+LY294002联合处理组p-Akt的校正灰度值为0.56±0.03，较rhS100A6组减少44.7%(P＜0.05);而rhS100A6+wortmannin联合处理组的校正灰度值为 0.45±0.03，较 rhS100A6组减少53.1%(P＜0.05)，见图3。结果提示PI3K抑制剂LY294002和wortmannin均能够部分逆转rhS100A6诱导的143B细胞中磷酸化Akt的上调。

4 LY294002和wortmannin均能够部分逆转rhS100A6对143B细胞的促增殖作用

联合rhS100A6和PI3K抑制剂LY294002或wortmannin处理143B细胞1～4 d后，MTT结果显示，在处理1～4 d后空白组的A492值分别为0.256±0.033、0.303±0.059、0.326±0.084和 0.318±0.061，rhS100A6组的 A492值分别为0.288±0.025、0.467±0.035、0.589±0.068和 0.623±0.031，rhS100A6组较空白组分别增加12.5%、54.1%、80.7%和95.9%(P＜0.05);而rhS100A6+LY294002联合处理组的A492值分别为0.284±0.042、0.402±0.073、0.461±0.031和 0.474±0.026，较 rhS100A6组分别减少10.3%、23.9%、31.7%和58.4%(P＜0.05);rhS100A6+wortmannin联合处理组的A492值分别为0.267±0.042、0.356±0.073、0.393±0.031和0.414±0.026，较rhS100A6组分别减少17.2%、28.3%、44.5%和69.7%(P＜0.05)，见图4。结果提示PI3K抑制剂LY294002和wortmannin均能够部分逆转rhS100A6对143B细胞的促增殖作用。

5 LY294002和wortmannin均能够部分逆转rhS100A6对143B细胞的促迁移作用

联合rhS100A6和PI3K抑制剂LY294002或wortmannin处理143B细胞24 h后，Transwell迁移结果显示，空白组穿过的细胞数为32±3，rhS100A6组穿过的细胞数为86±4，rhS100A6组较空白组增加168.8%(P＜0.05);rhS100A6+LY294002联合处理组穿过的细胞数为57±5，较rhS100A6组减少37.9%(P＜0.05);rhS100A6+wortmannin联合处理组穿过的细胞数为52±4，较 rhS100A6组减少41.6%(P＜0.05)，见图5。结果提示PI3K抑制剂LY294002和wortmannin均能够部分逆转rhS100A6对143B细胞的促迁移作用。

Figure 3．The effects of LY294002 and wortmannin on rhS100A6-induced phosphorylation of Akt in 143B cells detected by Western blotting．Mean±SD．n=3．*P ＜0.05 vs blank group;#P ＜0.05 vs rhS100A6 group．图3 LY294002和wortmannin对rhS100A6诱导的143B细胞Akt磷酸化的影响

Figure 4．The effects of LY294002 and wortmannin on rhS100A6-induced proliferation of 143B cells detected by MTT assay．Mean ± SD．n=3．*P ＜0.05 vs blank group;#P ＜0.05 vs rhS100A6 group．图4 LY294002和wortmannin对rhS100A6诱导的143B细胞增殖活性的影响

讨 论

S100A6 由 Kuznicki等［4］首次在 Ehrlich 腹水瘤中发现，属于S100钙离子结合蛋白家族，具有EF手型结构，分子量约为10 kD。当它结合钙离子后随即发生蛋白构象的改变，使其经典的EF手型结构得以暴露，该EF手型结构可以与多种靶蛋白结合，如原肌球蛋白、CacyBP/SIP及某些膜连蛋白等［5］。Wei等［6］应用质谱分析在小鼠乳腺癌模型中发现血清中S100A6的量与肿瘤的发生发展呈正相关;Wang等［7］发现胃癌中S100A6的过度表达与病人的预后不良有关;Ilg等［8］在研究中发现在肿瘤边缘多有S100A6的异常表达，提示其可能与肿瘤的生长、侵袭和远处转移关系密切;Luo等［9］发现人骨肉瘤组织中存在S100A6的过度表达，其作用尚存争议。本课题组前期实验结果表明S100A6能促进人骨肉瘤细胞系143B的增殖及迁移侵袭［3］，关于S100A6对人骨肉瘤的具体作用机制尚未报道。PI3K/Akt途径是近年来发现的一条重要的细胞信号转导途径。研究表明，在多种肿瘤组织，如骨肉瘤［10］、胃肠道肿瘤［11］、乳腺癌和前列腺癌［12］等癌组织中均有Akt的过度表达及活化，Akt的活化能磷酸化多种下游靶分子，如Bcl-2家族、糖原合成酶激酶3(GSK3)和S6蛋白激酶等，对细胞的生存、凋亡和动力等有重要影响。Gao等［13］发现在卵巢癌细胞中通过激活PI3K/Akt/mTOR/p70S6K1信号通路可增加cyclins的表达，促进G1期发展，促进细胞增殖与分化。Grille等［14］发现AKT可通过诱导上皮间质转化促进鳞状癌细胞系的动力和侵袭;maseki等［15］发现Akt/GSK3β/snail信号通路可介导头颈鳞状癌细胞系的增殖与动力;庞瑞萍等［16］发现吲哚美辛可通过激活Akt/GSK3β/NAG-1信号通路诱导胃癌细胞的凋亡。在骨肉瘤治疗方面，某些抗肿瘤药物也可通过PI3K/Akt信号途径抑制骨肉瘤的生长和发展，比如松弛素可通过PI3K/Akt/VEGF通路促进Saos-2细胞的生长、侵袭以及血管发生［17］，木黄酮可通过下调PI3K/Akt信号通路从而增强吉西他滨对骨肉瘤的抗癌效应［18］。上述研究提示PI3K/Akt信号通路的激活对骨肉瘤的发生发展具有重要的作用。

Figure 5．The effects of LY294002 and wortmannin on rhS100A6-induced migration of 143B cells detected by Transwell assay．Mean ±SD．n=3．*P ＜0.05 vs blank group;#P ＜0.05 vs rhS100A6 group．图5 LY294002和wortmannin对rhS100A6诱导的143B细胞迁移活性的影响

基于上述研究，本研究拟探明S100A6对骨肉瘤的作用是否经由该途径。结果表明，rhS100A6在显著增强人骨肉瘤细胞143B的增殖和迁移能力的同时，也能够上调Akt的磷酸化，提示PI3K/Akt信号通路的激活可能参与介导rhS100A6对143B细胞的促增殖和迁移作用。随之，我们应用 PI3K抑制剂LY294002或wortmannin来验证我们的假设，实验结果与预期相符，即LY294002和wortmannin均在明显逆转rhS100A6诱导的143B细胞中Akt磷酸化的上调作用的同时，也逆转其对143B细胞的促细胞增殖和迁移的作用。所以我们认为S100A6对人骨肉瘤细胞143B的促增殖与迁移作用至少部分是通过激活PI3K/Akt信号通路实现的。

综上所述，本研究在一定程度上揭示了在S100A6介导的促人骨肉瘤细胞143B增殖及迁移的作用中PI3K/Akt信号通路的参与，为进一步阐明S100A6对骨肉瘤的作用及机制、甚至骨肉瘤的发生发展机制提供了实验依据，也为骨肉瘤的治疗研究提供了潜在的靶点。