余冬冬，耿果霞，张成娟，刘亚伟，胡靓华，曹华琳，李青旺*

(1.西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2.西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100；3.山东省安丘市人民医院，山东 安丘 052164)

精原干细胞(spermatogonial stem cells, SSCs)是指位于雄性哺乳动物睾丸的曲细精管生精上皮基膜内侧的一群具有高度自我更新能力和分化潜能的细胞，在哺乳动物中一般是指未分化的A型精原细胞[1]。作为一类原始的精原细胞，SSCs既能自我更新生成新的干细胞从而维持自身群体稳定，又能定向分化形成各阶段的生殖细胞，并能最终分化形成精子[2]。SSCs通过分化成精子而能向子代传递遗传信息，在雄性动物的精子发生过程中，SSCs的地位极其重要，SSCs是体内唯一的，能在细胞水平进行识别并研究其增殖、分化及调控的一种成体干细胞[3]。由于SSCs独具的生物学特性，对于干细胞生物学、医学、农牧业生产等领域均具有重要的理论和实践意义。

红景天多糖(Rhodiola Sachalinensis polysaccharides,RSP)为景天科景天属(Rhodiola)植物的干燥根及茎的多糖提取物，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、木糖与半乳糖醛酸组成的多糖[4]。近代药理学研究发现，红景天多糖具有抗疲劳、抗寒、抗氧化、抗衰老、耐缺氧、抑制肿瘤、调节血糖和抗细胞凋亡等多种生物活性，成为近年研究开发的热点。研究发现，红景天多糖对体外培养的人胃癌细胞具有明显的抑制作用[5]。虽然如此，但关于红景天多糖对于SSCs体外培养的作用未见相关报道。试验通过Sertoli细胞与SSCs细胞共培养的培养液中加入红景天多糖，对比了不同浓度的红景天多糖的作用，以碱性磷酸酶(AP)和RT-PCR为鉴定依据，探讨红景天多糖对SSCs体外增殖的影响，探寻促进SSCs体外增殖的方法，以期为促进SSCs体外培养提供一些参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 本研究小鼠为出生后6～8 d的健康、清洁级雄性昆白小鼠，由西安交通大学医学院试验动物中心提供。

1.1.2 红景天多糖的提取 参考张树山等[6]介绍的方法，将红景天粉碎后置于80 ℃蒸馏水浸泡5 h后取其上清液，然后经旋转蒸发仪浓缩，冻干处理经粉碎后所获得粉末即为红景天多糖，将其密封后置于室温保存。

1.2 试验方法

1.2.1 SSCs的分离和纯化 每次试验分别取仔鼠4 ～10只，脱颈处死后，无菌取出睾丸。去除附睾、白膜等，将暴露出来的曲细精管切成小段，并反复吹打。先用10倍体积于组织块的Ⅳ型胶原酶(1 mg/mL)和少量DNaseⅠ(1 mg/mL)消化30 min，以除去间质细胞和一些血管成分，消化期间每隔5 min摇动一次。 再加入10倍体积的胰蛋白酶(0.25%)消化5 min，期间不断吹打，然后用含10% 胎牛血清的等量DMEM终止消化。接着将细胞悬液移入离心管中以800 r/min 离心5 min，将收集后的细胞接种于含10 % 胎牛血清的DMEM(预先加入100 U/mL的青霉素、链霉素)培养皿内，未消化的组织成分用400目的细胞筛过滤除去，随后于37 ℃、5 % CO2饱和湿度条件下培养。根据SSCs和Sertoli细胞贴壁速度的不同进行进一步的纯化。

1.2.2 Sertoli细胞饲养层的制备 根据贴壁速度不同，将体外培养4 h后的未贴壁的精原细胞吸去，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液培养。选择生长较密集的Sertoli细胞培养皿，弃去原培养液，用10 μg/L的丝裂霉素C处理细胞4 h后，用胰蛋白酶消化收集细胞，重新加入含10 %胎牛血清的DMEM培养，待细胞贴壁后即可作为饲养层。

1.2.3 SSCs共培养 将分离获得的SSCs以约 1×105/cm2接种在预先制备好的Sertoli饲养层细胞上，每隔2 d更换1次培养液。基础培养液为DMEM培养液+100 U/mL青霉素和链霉素+1% 谷氨酰胺+1% 非必需氨基酸+1% 丙酮酸钠+体积分数10% 胎牛血清，再在基础培养液中分别加入0、100、200、300和400 ng/mL 红景天多糖，以不加入红景天多糖组为对照，每个处理有三个重复组，每隔48 h 观察细胞形态并检测其增殖状况。

SSCs增殖情况检测时，将SSCs在37 ℃ 用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)处理4 h，除去上清液，加入DMSO后置摇床上振荡20 min，以充分溶解蓝紫色结晶物甲瓒，用酶标仪于490 nm 处测量各孔的吸光值(OD490)。

1.2.4 SSCs的鉴定

1.2.4.1 碱性磷酸酶(AP)染色检测 将待染色的SSCs用PBS洗2次，加入4% 多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗2次，25 mL Tris-HCl(pH 9.0)漂洗1次，然后用NBT/BCIP AP显色试剂盒染色，避光孵化15～30 min后，PBS漂洗终止反应，400倍倒置显微镜下观察。

1.2.4.2 RT-PCR检测标记基因 取培养1周左右的SSCs，使用RNA提取试剂盒抽提细胞总RNA，两步法进行RT-PCR反应。PCR反应条件：94 ℃ 3 min预变性，94 ℃ 30 s变性，58 ℃ 40 s退火，72 ℃ 1 min延伸，30个循环，72 ℃ 5 min终末延伸，以β-actin基因为内参照，对获得的RT-PCR产物进行1 % 琼脂糖电泳检测，相关基因的引物序列见表1。

1.3 数理统计分析

试验数据以“平均数±标准差”表示，采用SPSS 18.0统计软件进行单因素ANOVA方差分析，P<0.05为差异有显著性意义。

2 结果与分析

2.1 幼鼠SSCs的形态

体外培养1周后，添加红景天多糖组均较对照组SSCs明显增加，其中添加量为300 ng/mL 的细胞生长最好。培养1周后的细胞形成了克隆团，且AP染色呈红棕色(见图1)。

表1 相关基因的引物序列Table 1 Primers designed for related genes

2.2 幼鼠SSCs的RT-PCR鉴定

标记基因的检测见图2。由图2可知，463 bp的β-actin 基因、395 bp 的GFRa-1基因以及369 bp的Thy-1基因均在目的细胞中表达，表明试验分离获得的细胞为SSCs。

2.3 红景天多糖对SSCs的增殖作用

精原干细胞增殖的MTT检测见图3。如图3所示，培养至第2 d时，除添加量为100 ng/mL组外，其余试验组OD490较对照组均差异显著(P<0.05)，各试验组间差异显著(P<0.05)；而培养至第4 d时，试验组与对照组OD490均差异显著(P<0.05)，添加400 ng/mL组与100 ng/mL和200 ng/mL组间差异不显著(P>0.05)，而其余组间均差异显著(P<0.05)，增殖率最高可达152%。

图1 小鼠精原干细胞的AP染色(400×)Fig.1 AP staining for mouse spematogonial stem cells(400×)

图2 标记基因的检测Fig.2 Identification of mouse SSCs with marker genes

图3 精原干细胞增殖的MTT检测Fig.3 MTT test for the proliferation of spermatogonial stem cells

3 讨 论

红景天为景天科景天属(Rhodiola)多种植物的干燥根及茎，具有抗疲劳、抗寒、抗衰老、抗微波辐射、耐缺氧、抑制肿瘤、调节血糖等多种功能，作为传统药材已有千年历史[7]。过去对其有效成分的研究集中在红景天苷、红景天素和酪醇上，随着研究的深入，红景天多糖因其独特的生理活性和药理作用而受到关注。红景天多糖为红景天干燥根及茎的多糖提取物，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、木糖和半乳糖等组成。红景天多糖作为传统的中草药提取物，具有抗衰老、抗氧化以及抗凋亡等多种生物活性。红景天多糖对小鼠心肌细胞有较强的保护作用，能够增强血液中的SOD活性[8]，并能增强四氧嘧啶和肾上腺素引起的肝糖原分解[9]，且具有明显的抗伤害感受作用[10]。在生殖系统保护方面，红景天多糖能提高猪精子的抗氧化能力，明显提高猪冷冻精子品质[11]。

AP是一种单酯磷酸水解酶，能在碱性条件下水解单酯释放磷酸，AP通过磷脂酰肌醇聚糖联接到细胞膜上定位在细胞表面，未分化细胞的AP表达量很高。作为成体干细胞的一种，SSCs分化程度很低，表现出较高的AP活性。大量研究表明，可借助细胞形态和AP活性可作为检验SSCs的依据。本试验结果表明加入红景天多糖后SSCs数量明显增加，细胞为集落样生长，并呈现出链状或葡萄串状生长的特点，AP染色结果符合SSCs的特征。

Thy-1、GFRa-1是目前体外鉴定SSCs常用的表面标志物，而不存在于Sertoli细胞中，而β-actin是持家基因，在Sertoli细胞和SSCs中均表达。本试验通过检测是否表达Thy-1、GFRa-1基因来鉴定细胞是否为SSCs，RT-PCR结果表明，Thy-1、GFRa-1基因均在所培养的细胞中表达，符合SSCs的基因特征，表明所培养的细胞为SSCs，这与李莲军等[12]的研究结果一致。

Kateri等[13]研究表明，决定干细胞的增殖和分化是由其内在调节机制和外界与其紧密联系的环境相互作用共同影响。Sertoli细胞作为SSCs的培养层，能够提供一个与体内SSCs增殖分化相类似的微环境，其分泌产生的GDNF能显著地促进SSCs的增殖。本试验中加入红景天多糖后SSCs增殖明显，增殖率可达152%。推测红景天多糖可能在人为构建的体外SSCs微环境中参与了Sertoli细胞对SSCs的免疫调节作用。另外，在获得SSCs的过程中，由于机械力的剪切以及酶处理等作用，而随后和饲养层细胞的共培养过程中各种成份的相互作用，SSCs可能会受到氧自由基的损伤。张奕等[14]研究证实，红景天多糖具有较强的清除超氧阴离子自由基(O2-)和抑制脂质过氧化作用的能力，推测红景天多糖对SSCs的促增殖作用可能与其提高抗氧化能力及对机体的免疫系统的调节作用相关，但其对精原干细胞增殖的作用机制以及高浓度对细胞增殖的抑制作用的机理仍待进一步研究探讨。而且由于红景天多糖的组成成份复杂，究竟是其中某一个组分还是多个组分的相互作用而对精原干细胞的体外增殖产生影响，仍有待进一步的研究。虽然本试验只是对SSCs的体外培养1周增殖的相关研究，但是SSCs的量显著增加，为今后SSCs的研究及应用提供新的思路和方法。

4 结 论

在以Sertoli细胞作为SSCs的培养层的培养体系中，添加红景天多糖能显著增加体外培养的SSCs数量，且最适添加量为300 ng/mL。培养1周后的细胞为集落样生长，并呈现出链状或葡萄串状生长的特点。红景天多糖能显著促进以Sertoli细胞作为滋养层的体外培养体系中SSCs增殖，为后续SSCs的体外培养、研究应用提供参考依据。

参考文献：

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[2] Jon M. Oatley，Ralph L. Brinster Spermatogonial stem cells[J]. Methods in enzymology, 2006, 419: 259-282.

[3] Toshie Kai，Allan Spradling. Differentiating germ cells can revert into functional stem cells in Drosophila melanogaster ovaries[J]. Nature, 2004, 428(6982): 564-569.

[4] 骆传环，舒 融. 红景天中糖组份的分析[J]. 中国医药工业杂志, 1997, 28(10): 463-464.

[5] 黄冰洋，郭 靖，魏 海，等. 红景天多糖研究进展[J]. 吉林医药学院学报, 2012, 32(2): 108-111.

[6] 张树山，李青旺，胡建宏，等. 红景天多糖对猪精子冷冻保护效果的研究[J]. 农业生物技术学报, 2010, 18(3): 519-525.

[7] 李西林，南艺蕾. 红景天多糖的化学药理研究进展[J]. 中国中医药信息杂志, 2006, 13(3): 109-110.

[8] 阎 琪，任桂凤. 硫酸化高山红景天多糖对感染病毒小鼠血液 SOD 和 LPO 的影响[J]. 中国中医基础医学杂志, 1997, 3(006): 28-30.

[9] 程秀娟，邸 琳，吴 岩. 高山红景天多糖降血糖作用[J]. 中国中药杂志, 1993, 18(9): 557-559.

[10] 周丽君，张 振，苏 丽，等. 高山红景天抗伤害感受作用初探[J]. 大连医科大学学报, 2003, 25(3): 181-182.

[11] Kaomei Guan，Karim Nayernia，Lars S Maier，et al. Pluripotency of spermatogonial stem cells from adult mouse testis [J]. Nature, 2006, 440(7088): 1 199-1 203.

[12] 李莲军，陆峻波，施江滨，等. 碱性磷酸酶细胞化学法检测体外培养精原细胞[J]. 云南农业大学学报, 2004, 19(3): 318-321.

[13] Kateri A, Moore，Ihor R, Lemischka. Stem cells and their niches[J]. Science, 2006, 311(5769): 1 880-1 885.

[14] 张 奕，刘永刚. 红景天苷抗大鼠肝星状细胞氧应激脂质过氧化作用的研究[J]. 中药材, 2005, 28(9): 794-796.