肖增鸿，黄昭亮，林月霞，董斌，田素娟

单克隆抗体被广泛应用于免疫学、药理学、细胞生物学、微生物学、临床疾病的预防、诊断和治疗及畜牧产品违禁限制药物的检测等。其生产方式主要有小鼠体内诱生腹水和杂交瘤细胞体外培养；前者生产成本低，是目前用于体外应用的主要生产方式。但无论哪种方式生产的单抗，均含有大量的杂蛋白，主要包括白蛋白、转铁蛋白、血清白蛋白、α-巨球蛋白、脂类蛋白以及其他宿主蛋白等，不能直接应用于体外。因此需对单抗进行后续的纯化，以达到使用要求。但目前尚没有一种方法能满足不同目的需要，尤其是在规模化制备单克隆抗体问题上显得更为突出。为了在大规模单克隆抗体的制备过程中，尽量减少经济成本与时间成本，对腹水型单抗纯化工艺进行了探讨[1-2]。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

全自动数码凝胶图像分析系统、垂直电泳仪由上海天能科技有限公司生产；Moderl 680 酶标仪为美国 Bio-Rad 公司产品；Ultrospec1100pro 紫外可见分光光度计为美国 Amersham Biosciences 公司产品；核酸蛋白检测仪为上海青浦沪西仪器厂产品；小型台式记录仪购自上海自动化仪表三厂；蛋白 G 亲和层析柱和 DEAE 阴离子层析柱为美国GE 公司产品；Sephadex G-25 由美国 Pharmacia公司生产；4-D10 抗氯霉素单抗（IgG1）腹水由本实验室制备；辣根过氧化物标记羊抗鼠 IgG 由精美公司分装；牛血清白蛋白 BSA 由瑞士 Roche公司分装；硫酸铵、正辛酸等为国产化学试剂。

1.2 方法

1.2.1 腹水预处理 –20 ℃ 保存的原腹水置于4 ℃ 解冻过夜，取出后 4 ℃ 条件下，10000×g 离心 10 min，取上清，4 ℃ 保存。

1.2.2 两步硫酸铵沉淀法（AS 法） 取预处理腹水，用 0.02 mol/L pH 7.2 的磷酸盐缓冲液（PB）稀释 3 倍，再逐滴加入等量 pH 7.0 饱和(NH4)2SO4溶液，使其饱和度达到 50%，边加边搅拌，充分混匀后冰面静置 30 min。4 ℃ 条件下，10000×g 离心 10 min，取上清，将沉淀于 2 倍原腹水体积的 PB 复溶，再逐滴加入 8 倍原腹水体积 pH 7.0 饱和硫酸铵，使其饱和度达到 33%，充分混匀后冰面静置 30 min。4 ℃，10000×g 离心 10 min。弃上清，将沉淀 4 ℃ 保存。

1.2.3 辛酸-硫酸铵沉淀法（CA-AS 法） 取预处理腹水，用 0.06 mol/L pH 4.4 醋酸缓冲液稀释3 倍，用 1 mol/L HCl 调节 pH 至 4.8；按每毫升稀释腹水加 11 μl 辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于 30 min 内加完，4 ℃ 静置 2 h。取出后，4 ℃ 条件下，15000×g 离心 30 min，取上清，加入 1/10 体积的 0.01 mol/L PBS，用 1 mol/L NaOH 调 pH 至 7.2，在冰面操作加入饱和硫酸铵至 45% 饱和度，静置 30 min。取出后，10000×g离心 30 min，弃上清，将沉淀 4 ℃ 保存。

表1 不同方法纯化后蛋白浓度比较Table1 Comparison of purified protein concentrations by different methods

1.2.4 蛋白 G 亲和层析法 将辛酸-硫酸铵法获得的沉淀以 0.02 mol/L pH 7.0 PB 溶液重溶，过蛋白 G 亲和柱。以 0.1 mol/L pH 2.7 Gly-HCl 为洗脱缓冲液，流速 1 ml/min 洗脱，以 1.0 mol/L pH 9.0 Tris-HCl 为中和缓冲液进行接样收集蛋白。提纯样品保存在 –20 ℃。

1.2.5 DEAE 离子交换层析 将辛酸-硫酸铵法获得的沉淀以 0.01 mol/L pH 7.2 PB 溶液 A 重溶，经 Sepharose G-25 除盐后，过 DEAE 阴离子层析柱。以含 0.5 mol/L NaCl 的 0.01 mol/L pH 7.2 PB 为洗脱液 B，A、B 液混合进行线性梯度洗脱，收集蛋白峰。提纯样品保存于 –20 ℃ 环境中。

1.2.6 蛋白浓度鉴定 采用紫外分光光度计对抗体进行检测。测定前用溶解抗体的 PB 溶液调零，分别测定 3～4 个数值，取其平均值。利用公式：蛋白含量(mg/ml) =（1.45×OD280–0.74×OD260）× 稀释倍数。

1.2.7 蛋白分子量鉴定 以还原型 SDS-PAGE进行分析，具体方法参照文献[1]，分离胶浓度为10%。

1.2.8 蛋白纯度鉴定 以非还原型 SDS-PAGE进行分析，具体方法参照文献[1]，分离胶浓度为7.5%。

1.2.9 抗体免疫活性鉴定 采用间接 ELISA 法检测纯化后抗体效价。以合适浓度的包被抗原CAP-OVA 包被酶标板。根据蛋白浓度检测结果及SDS-PAGE 鉴定的纯度不同，对样品进行适当稀释，使纯化后 IgG 浓度与原腹水浓度相同。以原腹水按照 1∶1000 稀释液为阳性对照，SP2/0 小鼠骨髓瘤细胞 1∶1000 稀释腹水为阴性对照。具体操作方法参照文献[2]。

2 结果

2.1 单克隆抗体分子量与纯度、浓度鉴定

2.1.1 纯化前后抗体浓度测定 不同方法腹水纯化前后的蛋白含量见表 1，由此可以看出不同纯化方法的收率。

2.1.2 单克隆抗体分子量鉴定 IgG 抗体在 2-巯基乙醇作用下，免疫球蛋白中的二硫键被破坏，重链与轻链分开，因此，在还原型 SDS-PAGE 电泳中，可见两条明显的条带，两者分子量分别为：重链约 50 kD，轻链约 28 kD，如图 1 所示。单克隆抗体的分子量为 156 kD。

图1 单克隆抗体还原型 SDS-PAGE 电泳Figure1 Reduced SDS-PAGE electrophoresis of antibody

2.1.3 单克隆抗体纯度鉴定 由于 IgG 抗体由轻链与重链组成，还原型 SDS-PAGE 电泳很难直观分析其纯度，如图 2 所示，只能粗略观察到，CA-AS 法纯化后腹水纯度略大于两步 AS 法纯化后腹水。利用凝胶成像系统进行分析，CA-AS 法纯化后单抗纯度可达 44%，而两步 AS 法则只能去除含量较大的大分子蛋白条带，纯度约为 25%。

图2 粗提腹水还原型 SDS-PAGE 电泳Figure2 Reduced SDS-PAGE electrophoresis of the crude sample

为了进一步比较单抗纯化的效果，采用非还原型 SDS-PAGE 电泳检测了抗体的纯度。SDS-PAGE电泳分离胶浓度为 7.5%，然后借助电泳条带分析软件进行分析，从而精确判断抗体的纯度。利用凝胶成像系统进行分析，可得：蛋白 G 亲和层析纯化样品为单一条带，DEAE 离子交换层析纯化样品还有一些未知大分子残留，纯度 87%（图 3）。

2.2 单克隆抗体纯度、回收率

通过凝胶成像系统进行分析，对分析结果进行计算，可得到各种纯化方法纯化后的 IgG 纯度及相应的回收率，如表 2 所示。AS 法回收率最高，达到 63%，但其纯度明显低于 CA-AS 法；蛋白 G亲和层析法纯度达到 100%，但其回收率小于10%；DEAE 回收率 11.7%，明显高于蛋白 G 亲和层析法 6.9%，纯度 87%。

2.3 纯化后抗体间接 ELISA 效价检测

纯化后抗体效价如表 2 所示。将纯化前后腹水调节至相同浓度，通过有限稀释法设定检测梯度，以 OD630为参照，测定 OD450，以 P/N ≥ 2.1临界值为最高稀释倍数，即相应效价。结果表明：原腹水效价为 2.048×106，AS 法和 CA-AS 法纯化后抗体活性略低于原腹水；蛋白 G 法纯化后效价为 1.28×105，低于 DEAE 法，抗体活性损失较DEAE 法大。

图3 非还原型 SDS-PAGE 电泳测定单克隆抗体纯品纯度Figure3 SDS-PAGE electrophoresis of samples

3 讨论

单克隆抗体在生物检测和医学、畜牧领域的应用越来越广泛，而其纯度与活性是影响其质量的关键因素。当前实验室常用的小鼠 IgG1、IgG2a、IgG2b 类单克隆抗体纯化方法中，常用沉淀法和层析法。常用粗纯的沉淀法有 AS 法、CA-AS 法，一般回收率高，但纯度低，活性较好，其中 AS 法收率较高，CA-AS 法纯度较高、抗体活性好[2-4]。而经 AS 法或 CA-AS 法初步纯化再联合 DEAE阴离子交换层析法或蛋白 A、G 亲和层析进一步纯化，纯度可达 87%～100%[2,5-6]，但回收率较低，CA-AS 法联合蛋白 A 亲和层析法回收率为26%[5]，AS 法联合 DEAE 阴离子交换层析法回收率为 8.9%[2]。本研究分别探讨了 AS 法、CA-AS法、CA-AS 法联合 DEAE 阴离子交换层析法与CA-AS 法联合蛋白 G 亲和层析法纯化抗氯霉素的 IgG1 类单克隆抗体，AS 法、CA-AS 法的回收率与周玉等[2]、梁荣等[4]的结果一致，但抗体纯度、活性降低，还有待进一步研究。CA-AS 法联合蛋白 G 亲和层析法纯化，纯度高，但回收率、活性低，成本高。采用 CA-AS 法联合 DEAE 阴离子交换层析法，纯度比 CA-AS 法联合蛋白 G 亲和层析法稍低，但显著提高了回收率与活性，比周玉等[2]报道的回收率 8.9% 有所提高。综合考虑，CA-AS 法联合 DEAE 阴离子交换层析法，与 AS法、CA-AS 法及 CA-AS 法联合蛋白 G 亲和层析法相比，无论在抗体回收率、抗体活性、抗体纯度等方面存在较大优势，且此法操作简便，可重复使用，生产成本较低，在实验室检测试剂盒制备方面，利用此方法纯化单克隆抗体，有一定的应用价值。

表2 不同纯化方法纯化后蛋白纯度、回收率与效价Table2 Comparison of purity, recovery and antibody titer by different purification methods

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