杨 洋，朱运良

郑州大学基础医学院法医学教研室 郑州 450001

短串联重复序列(short tandem repeat，STR)又称为微卫星DNA，是存在于人类基因组DNA中的一类具有长度多态性的DNA序列，不同数目的核心序列呈串联重复排列[1]。STR在不同种族和地域人群中有很大的差异。作为一种遗传标记，STR可以通过连锁分析应用到家系研究中，即利用STR位点在家系中进行分型，来判断遗传标记在家系中是否与疾病产生共分离。作者选取了先天性静止性夜盲症(congenital stationary night blindness,CSNB)候选致病基因RHO、PDE6B和GNAT1附近的6个STR基因座，针对河南汉族人群100名健康无关个体进行了遗传多态性研究，获得群体遗传学和法医学参数，期望为家系研究、CSNB致病基因筛选和定位提供理论依据，为法医学的个体识别、亲权鉴定提供一定的参考[2]。

1 材料与方法

1.1样本100例无血缘关系的河南汉族正常个体血样由河南省人口与计划生育科学研究院提供，4 ℃保存。

1.2微卫星的查找及引物设计从GenBank下载RHO、PDE6B、GNAT1这3个基因的DNA序列，用Tandem Repeats Finder在线软件(http://tandem.bu.edu/trf/trf.html)在上下游查找到6个STR基因座，重复单位为4核苷酸，6个STR基因座的基本参数见表1。6对引物序列均用Primer 5.0软件设计，引物序列见表2，由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 6个STR基因座的基本参数

表2 6个STR基因座的引物序列

1.3PCR扩增及结果分析PCR扩增体系为20 μL，内含DNA模板1 ng,上、下游引物各1.5 μL(5 μmol/L)，dNTP 0.4 μL(10 mmol/L)，Taq聚合酶1 μL(1 U/μL)，10×Buffer(含Mg+2)2 μL,ddH2O补足至20 μL。采用降落PCR反应程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s，每一循环退火温度降低0.5 ℃，共14个循环；然后94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s，20个循环；最后72 ℃ 8 min，4 ℃保存。PCR产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染显色。用阿拉伯数字1～7分别表示从小到大的等位基因。

1.4数据处理采用美国Promega公司提供的PowerStatsV12.xls对6个STR基因座进行统计分析，得出各基因座的等位基因及基因型频率、杂合度(heterozygosity，H)、个体识别率(discrimination power，DP)、多态性信息含量(polymorphic information content，PIC)、非父排除率(excluding probability of paternity，PE)及匹配概率(match probability，MP)、父权指数(paternity index，PI)。对这6个基因座进行Hardy-Weinberg 平衡检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1河南汉族人群中6个STR基因座基因型的分布河南汉族人群中D3R1检出5个等位基因14种基因型，D3R2检出3个等位基因6种基因型，D4P1检出5个等位基因12种基因型，D4P2检出4个等位基因9种基因型，D3G1检出4个等位基因10种基因型，D3G2检出5个等位基因13种基因型。6个基因座在河南汉族人群中的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。各等位基因频率以及Hardy-Weinberg检验结果见表3。

表3 6个STR基因座的等位基因频率及Hardy-Weinberg平衡检验

2.2河南汉族人群中6个STR基因座的多态性这6个STR基因座在河南汉族人群中的H、PIC、DP均较高，具体的遗传学参数结果见表4。

表4 河南汉族人群中6个STR基因座的遗传多态性参数

3 讨论

CSNB是一类主要损害视杆系统的家系遗传性视网膜疾病，其临床特点为患者出生后即出现夜盲，白天视力和视野一般正常，无眼底疾患且病况终生不变[3]。该病遗传方式符合孟德尔遗传规律，有常染色体显性遗传(autosomal dominant,AD)、常染色体隐性遗传(autosomal recessive,AR)和X连锁隐性遗传3种方式(X-linked recessive,XL)，其中以AD遗传方式最为常见。

STR在人类基因组中大量存在，一般认为人类基因组DNA中平均每6～10 kb就有一个STR位点，其多态性成为法医物证检验个体识别和亲子鉴定的丰富来源[4]。不同人体基因组微卫星DNA重复单位的数目是可变的，因此形成了极其复杂的等位基因片段长度多态性。近年来有关STR及其在法医学中的应用已有大量报道，但STR位点在人类基因组中分布极广，还有大量的STR位点尚待进一步开发研究，如何筛选出更多杂合度高、多态信息含量丰富的STR位点成为当今法医界研究的重点[5]。陈辉等[6]就利用位于常染色体上的24个STR位点对河南汉族人群做过相关报道。

作者选取的RHO、PDE6B、GNAT1这3个基因均是AD-CSNB的候选致病基因。作者在这3个基因上、下游区域选取6个STR基因座，通过对河南汉族100个健康无关个体进行群体调查，得到群体遗传学参数。其中D3R1、D3R2、D4P1、D4P2、D3G1、D3G2的PIC为0.550～0.730(≥0.5),DP为0.761～0.891(>0.7)[7]，说明这6个STR基因座是一组较好的遗传标记，适合于家系研究以及CSNB致病基因连锁研究。

遗传标记的多态性及其应用价值可用H、PIC和DP来衡量，Gill等[8]提出把DP≥0.9,H≥0.7,PIC≥0.7，PE>0.5作为高鉴别能力STR位点的标准。该研究中D3R1、D3R2、D4P1、D4P2、D3G1和D3G2的H分别为0.800、0.660、0.700、0.760、0.710和0.760，可见仅有D3R2不符合此标准。一般认为，H越高说明该遗传标记的杂合性越大,在法医学个体识别中的应用价值就越大。这6个STR基因座的DP在0.7～0.9，在群体中的个体识别率偏低，可能是由于样本量较少的缘故。这6个STR基因座中仅有D3R1、D4P2、D3G2 的PE>0.5，表明这3个基因座的非父排除率较高，比较适用子亲子鉴定的研究。综合各遗传学参数，可知D3R1、D4P2和D3G2在法医学方面具有一定的应用价值，但是考虑到D3R1、D3G2位于同一染色体上，两者是否具有连锁关系，还有待于进一步的研究，因此还无法确定在法医学鉴定中是否可以进行多个基因座的联合检测。

致谢：感谢河南省人口与计划生育科学研究院的王凤羽和王艳丽老师给予的帮助和支持。

[1]Payseur BA,Place M,Weber JL.Linkage disequilibrium between STRPs and SNPs across the human genome[J].Am J Human Genet,2008，82(5):1039

[2]Krenke BE,Tereba A,Anderson SJ,et al.Validation of a 16-locus fluorescent multiplex system[J].J Forensic Sci,2002,47(4):773

[3]Kocyla-Karczmarewicz B,Gralek M,Juszko J,et al.Congenital stationary night blindness[J].Klin Oczna,2004,106(3 Suppl):509

[4]孙莉,孟晓峰,陈辉,等.河南汉族6个STR基因座的遗传多态性研究[J].医药论坛杂志,2008,29(2):13

[5]张建勋,乐晓萍,杨洋,等.河南汉族人群6q24-25.1区域STR 基因座的遗传多态性[J].郑州大学学报：医学版，2011,46(4):566

[6]陈辉,徐朝阳,李晓文,等.常染色体短串联重复序列基因座在河南汉族人群亲子鉴定中的应用[J].郑州大学学报:医学版,2010,45(6):983

[7]Nei M.Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals[J].Genetics,1978,89(3):583

[8]Gill P,Urquhart E,Millican N,et al.A new method of STR interpretation using inferential logic-development of a criminal intelligence database[J].Int J legal Med,1996,109(1):14