周梅华，鲁 严，李 雪，吴 迪，朱文元

（1.江苏省工人汤山疗养院皮肤科，江苏 南京 211131；2.南京医科大学第一附属医院皮肤科，江苏 南京 210029；3.南京市妇幼保健院皮肤科，江苏 南京 210029）

自体黑素细胞培养移植是治疗白癜风的一种有效方法，近年来国内外有不少使用该方法成功治疗白癜风的报道[1]。我们在传统的黑素细胞培养的基础上对培养基和移植方法进行了改进，应用于白癜风的移植治疗，取得了较好的效果。现报道如下。

1 资料和方法

1.1 病例资料

白癜风患者均为2011年9月～2012年6月在南京医科大学第一附属医院皮肤科就诊的患者，符合中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会色素病学组制定的标准。本组患者共13例，年龄18岁～55岁，男8例，女5例，平均病程6.78年，均为稳定期寻常型白癜风，均无手术禁忌症。总共21处皮损。试验方案经医院伦理委员会批准，手术前患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 黑素细胞的培养[2]常规消毒患者供皮区，局部浸润麻醉，用无菌刀片采取表皮，漂洗数次，加入含Dispase酶的D-Hanks液中37℃ 3h，挑弃部分真皮，将组织剪成约0.2cm的小片，用0.25%胰蛋白酶37℃吹打消化20min，再用10%胎牛血清终止消化。用D-Hanks液洗涤细胞后1500rpm离心10min，收集沉淀细胞重悬浮于我们前期研制出以rhG-CSF为主要促细胞增殖因子的Ham F12培养基[3]。细胞接种密度为5×105/ml，置于5% CO2培养箱37℃孵育。6h后换液去除未贴壁细胞，48h后改用不含geneticin的培养基，3天换液，当细胞长满70～80%时，用2.5 g/L胰酶消化传代。

1.2.2 黑素细胞的移植 常规利多卡因局部浸润麻醉后，采用表皮磨削机磨削白斑区，以点状出血为宜，后表面覆盖生理盐水湿纱布备用。将预先制备好的黑素细胞-卡波姆胶混合物[3]轻轻涂抹于受植区，约0.5cm厚，再覆盖凡士林油纱布，并加压包扎固定。10天去除纱布，1个月后开始观察疗效。所有病例均随访至少6个月。

1.2.3 疗效判断 采用Adobe Photoshop 7.0图像软件系统评估复色面积，疗效判断参照许爱娥[4]：包括痊愈：色素恢复面积≥90%；显效：50%≤色素恢复面积＜89%；好转：10%≤色素恢复面积＜49%；以及无效：色素恢复面积＜10%。有效率=痊愈率+显效率。

表1 体外培养自体黑素细胞移植治疗白癜风临床效果统计 处（%）

1.2.4 统计学处理 采用SPSS l6.0软件进行统计分析。

2 结果

2.1 黑素细胞培养

黑素细胞接种培养瓶后，逐渐贴壁、拉长并出现伪足和分支，约7天后呈现典型的黑素细胞形态。根据皮损面积大小和所需黑素细胞数目，行黑素细胞计数与传代。

2.2 黑素细胞移植效果

移植1个月后观察15处皮损有明显的色素产生，6处皮损2个月后产生色素。除1例患者为点状复色，其余为均匀复色形式，无明显斑驳现象，且产生的色素无脱失现象（图1）。3个月后，13例21处皮损痊愈8处，显效11处，好转2处，无效0处，总有效率90.48%。见表1。所有病例均随访至少6个月，未出现疤痕、过敏和其他不良反应。

图1 体外培养自体黑素细胞移植治疗白癜风前后对比

3 讨论

黑素细胞体外培养自1987年开始用于移植治疗白癜风，成为白癜风治疗较先进的方法之一。传统的表皮移植治疗白癜风操作简单，但移植面积相对较小，且移植成活区皮肤易出现“鹅卵石”样外观，与周边正常皮肤不易融合。而黑素细胞体外培养技术具有细胞扩增数量多，移植面积大等优点。传统黑素细胞培养基是应用TPA和CT[5]，刺激黑素细胞的增殖，增加树突，促进黑素细胞的附着。但由于TPA具有强致癌性，CT作为一种神经毒素，所培养的黑素细胞安全性受到质疑，临床应用受到限制。Hu培养基[1]使用bFGF、HGF等代替TPA、CT，解决了细胞安全性的问题，但是bFGF、HGF价格昂贵，增加了细胞培养成本，给患者带来经济负担。前期研究我们已证实人黑素细胞表面可表达G-CSFR，G-CSF通过与黑素细胞表面的G-CSFR结合，具有较强的促黑素细胞增殖的能力[6]。G-CSF是一种人体的生理性细胞因子，可由单核巨噬细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等诱导产生。其基因重组产品（rhG-CSF）被广泛用于各种白细胞减少症、神经保护等[7]，该产品安全性高，价格便宜，容易获得，因此我们创建了以rhG-CSF为主要细胞增殖因子的新型黑素细胞培养基。在细胞移植技术方面，我们也进行了改良，通常采用细胞悬液滴种法移植黑素细胞，但悬液具有流动性，会造成黑素细胞在白斑区不易附着，导致远期达不到均匀复色，影响美观。我们以卡波姆胶作为黑素细胞的载体可以克服上述缺点，能够均匀涂布于皮肤组织，取得了良好的疗效。本研究结果提示，采用新型黑素细胞培养基及卡波姆胶系统可以用于体外培养黑素细胞移植治疗白癜风，具有培养黑素细胞数量多、移植后色素恢复均匀、安全等优点，值得临床推广和应用。

[1]Hu DN，McCormick SA，Seedor JA，et al. Isolation，purification and cultivation of conjunctival melanocytes.Exp Eye Res，2007，84（4）：655-662.

[2]Mulekar SV. Melanocyte–keratinocyte cell transplantation for stable vitiligo. Int J Dermatology，2003，42（2）：132-136.

[3]鲁严，周梅华，李雪，等.新型黑素细胞涂布法移植卡波姆胶载体制备研究.中国中西医结合皮肤性病学杂志，2012，11（4）：208-210.

[4]张迪敏，洪为松，傅丽芳，等.个体化培养自体黑素细胞移植治疗白癜风. 中华皮肤科杂志，2010，43（10）：721-725.

[5]Kim D S，Park SH，Park C. Transforming growth factorbeta1 de-creasesmelanin synthesis via delayed extracellular signal-regulated kinase activation[J].Int JBiochem CellBio，2004，36（8）：1482-1491.

[6]周梅华，李雪，鲁严，等粒细胞集落刺激因子及其受体对人黑素细胞增殖及酪氨酸酶活性的影响，2012，45，（8）：564-568.

[7]Ringden OT，Le-Blane K，Remberger M. Granulocyte and granulocyte-macrophage colony-stimulating factors in allografts：Uses，misuses，misconceptions，and future applications. Exp Hematol，2005，33（5）：505-512.