邓 婕 ，王慧娟，苏龙翔，张 鑫，肖 坤，贾艳红，解立新

脓毒症是一种由各种病原微生物感染和全身炎性反应综合征所致的临床综合征，可进一步发展为脓毒症休克和多器官功能障碍(MODS)［1］。早期诊断脓毒症，尽早准确地评价脓毒症的病情严重度和判断预后，及时干预治疗，可减少早期脓毒症向严重脓毒症发展的概率，亦是进一步降低脓毒症患者病死率的关键。近年来有研究发现微小RNA(miRNA)可以作为诊断脓毒症的一个新的生物标记物［2］，并且miRNA-122 可从基因转录水平判断脓毒症病情的预后情况［3］。但是，对于miRNA-122在脓毒症中的动态表达国内外并未有报道。因此，笔者选择观察脓毒症患者血清中的miRNA-122 表达量的动态变化情况，探讨它与脓毒症严重程度的关系，分析血清miRNA-122 是否可以作为一种新的血清学标志物，用于脓毒症早期诊断。

1 对象与方法

1.1 对象 选择2011-10至2012-05 本院急诊重症监护病房(EICU)、呼吸重症监护病房(RICU)及外科重症监护病房(SICU)满足脓毒症诊断标准的住院患者52例，其中一般脓毒症23例，重症脓毒症29例。诊断标准根据1991年ACCP/SCCM 联席会议对SIRS、脓毒症(sepsis)、严重脓毒症(severe sepsis)、脓毒性休克(septic shock)的定义［4］，并参照2002年“国际脓毒症定义会议”的定义和诊断标准［1］;排除标准如下:年龄＜18岁;入组24 h 内死亡者;粒细胞缺乏(＜0.5 ×109/L);合并HIV 感染。另外，选择健康人23名作为健康对照组。本研究纳入的52例脓毒症患者年龄(56.2 ±19.3)岁，范围19～87岁，健康对照组年龄(59.2 ±18.3)岁，范围26～82岁，两组年龄差异无统计学意义(P=0.52 4)。该研究已经通过本院伦理委员会审批，批号20110824-005;Clinical Trial 注册号NCT01459822。所有纳入研究的对象均获得充分告知并签署知情同意书。

1.2 数据采集 记录患者的基本临床信息，包括姓名、性别、年龄、原有慢性疾病史、入院主因、转归(28 d 生存或死亡)。记录患者入组第1 天的白细胞计数、C 反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、急性生理与慢性健康评分(acute physiology and chronic health evaluationⅡ，APACHEⅡ)及序贯器官衰竭估计(sequential organ failure assessment，SOFA)评分。记录健康对照组的性别、年龄。

1.3 实验主要试剂与仪器 mirVana miRNA 提取试剂盒(美国Ambio 公司)，miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒(中国天根生化公司)，miRcute miRNA 荧光定量检测试剂盒(中国天根生化公司)，MJ Mini 梯度PCR 仪(美国Biorad 公司)，IQ5 PCR实时荧光定量检测系统(美国Biorad 公司)。

1.4 RNA 提取及RT-PCR 患者及健康对照组采集静脉外周血，外周血经3000 r/min 离心分离出血清置-80℃冰箱保存待测。按照mirVana PARIS 试剂盒的使用说明书进行血清总RNA 的提取。提取的总RNA 进行下一步的反转录，配制RT 反应体系，充分混匀后进行反转录(参考反转录试剂盒说明书)。参考天根生化PCR 试剂盒说明书，确定PCR 的反应体系。反应总体积为20 μl。反应体系为:2 ×miRcute miRNA 预混料:10.00 μl;RT 反应产物:2.00 μl(2.00 μg);自备引物:0.40 μl;反向引物:0.40 μl;DEPC 水:7.20 μl。利用IQ5 PCR 实时荧光定量检测仪上进行miRNA 定量检测。循环参数设定为:95℃，10 min 活化Taq 酶，95℃，15 s，60℃，1 min，进行40个循环。以5S rRNA为内参，miRNA 的表达量表示为(2-△Ct)，计算公式如下:-△Ct=CtmiRNA-Ct5S。

1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0 统计软件，所有数据均进行正态性检验，正态分布的计量资料以表示，多组间均数比较采用方差分析，两组间比较采用成组t 检验。非正态分布的计量资料以中位数及四分位数表示，两组间均数比较采用Mann-Whitney U 检验。为检测指标的诊断价值绘制了ROC 曲线，并计算了曲线下面积。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般资料 52例脓毒症患者SOFA 评分为4～19 分，平均为(8.4 ±3.2)分，APACHE Ⅱ评分范围6～32 分，平均为(16.3 ±6.3)分，28 d 病死率为55.8%(29/52)。一般脓毒症组与重症脓毒症组之间年龄(P=0.450)、性别(P=0.086)差异无统计学意义，而SOFA 评分(P=0.001)、APECHE Ⅱ评分(P=0.010)及慢性肾脏疾病(P=0.008)，差异有统计学意义(表1)。

表1 52例脓毒症患者入组时的一般资料 ()

表1 52例脓毒症患者入组时的一般资料 ()

2.2 脓毒症患者血清中miRNA-122 的诊断价值在14 d 病程中，脓毒症组在每一时间点的miRNA-122 表达量(以2-ΔCt表示)与健康对照组比较，差异有统计学意义(均P＜0.01)。健康组的血清miRNA-122 的表达量范围是3.450 (1.374，11.146)，脓毒症组的血清miRNA-122 的表达量范围见表2。

表2 脓毒症组血清miRNA-122 表达量在不同时间点与健康对照组的比较(中位数;第25 百分位数，第75 百分位数)

为了检测miRNA-122 早期诊断脓毒症的价值，笔者绘制了ROC 曲线(图1)，入组第1 天的miRNA-122 诊断脓毒症的曲线下面积是0.774(95%CI，0.670-0.879)。当miRNA-122 的相对表达量是0.710 时，miRNA-122 诊断脓毒症的特异性是95.7%，敏感性是53.8%。

图1 MiRNA-122 早期诊断脓毒症ROC 曲线

2.3 不同病情严重程度的脓毒症患者血清中miRNA-122 水平的变化 一般脓毒症组23例和重症脓毒症组29例(包括严重脓毒症患者21例与脓毒症休克患者8例)比较，两组间miRNA-122 的表达水平在各时间点上存在统计学差异(P＜0.01)，且重症脓毒症组的表达量在各个时间点均高于一般脓毒症组，而各组在组内各时间点比较，差异无统计学意义(表3)。

表3 一般脓毒症组与重症脓毒症组的血清miRNA-122 的表达量范围(中位数;第25 百分位数，第75 百分位数)

3 讨 论

脓毒症是感染引起的十分复杂的炎性反应，是多种炎性因子共同作用的结果，也是重症监护病房患者死亡的主要原因。所以脓毒症的早期诊断和治疗对患者的预后至关重要。近年来，对发现及确诊脓毒症的新型生物标志物及其相关功能的研究一直是各国学者们研究的热点。

MiRNA 是一种长约22nt 的微小分子RNA，通过直接作用于信使RNA(mRNA)或者通过抑制蛋白质的翻译来调节蛋白编码基因的表达［5］。第1 篇报道的关于miRNA 可作为诊断脓毒症的新的生物标志物的文献，是Vasilescu 等［6］发现和证实了白细胞和血浆中miRNA-150 水平同脓毒症的预后情况相关，而且它可以作为早期诊断脓毒症的一项指标。而Wang Jiafeng 等［7］的研究则证实了miRNA-146a和miRNA-223 可以区分非感染SIRS 患者同脓毒症患者，也说明这两种miRNAs 可以作为脓毒症患者的血清标志物。

本研究中，通过比较脓毒症患者入组后不同时间点与健康人群血清中miRNA-122 表达量，说明脓毒症患者的血清miRNA-122 表达量相对健康人群是下降的。用入组第1 天的miRNA 表达量做ROC 诊断分析得出其诊断的特异性是95.7%，敏感性是53.8%，这些数据都说明血清miRNA-122 可以作为早期脓毒症的特异性诊断标志物。本研究中，严重脓毒症组的miRNA-122 表达量在各个观测时间点都高于一般脓毒症组，间接说明miRNA-122 表达量预警脓毒症患者疾病严重程度方面具有积极的临床意义。

在笔者前期的研究中，虽然证实了血清miRNA-122 表达量在脓毒症生存组和脓毒症死亡组中存在统计学差异，并且在死亡组中相对高表达，但是并未验证其与脓毒症严重程度的相关性，也未对miRMA-122 能否诊断脓毒症做出研究［8］。本实验则发现了血清miRNA-122 的表达量在脓毒症患者入组后的14 d 病程中各时间点与健康对照组均存在统计学差异，ROC 诊断试验结果也说明血清miRNA-122 可作为脓毒症的新型生物学诊断指标。MiRNA-122 的表达量在重症脓毒症组表达高于一般脓毒症组。

脓毒症可导致强烈的免疫抑制和机体损坏［9-11］。有研究显示，在脓毒症中阳离子氨基酸转运蛋白(cationic amino acid transporter，CAT-1)的mRNA 表达水平升高了86%［12］。而Chang 等［13］研究发现CAT-1 是miR-122 最重要的作用靶点之一。MiRNA-122 中有8个CAT-l 的mRNA 潜在作用位点，2个位于5＇非编码区;6个位于γ 端非翻译区，其中3个能与CAT-1 的核苷酸序列结合，来抑制蛋白质的合成，从而影响肝功能，具体作用机制并不清楚。在脓毒症中，免疫抑制及机体损坏等一系列复杂的炎性反应可能阻断了miRNA-122 和靶基因mRNA 结合通路，导致CAT-1 表达增加。本研究虽然证实血清miRNA-122 的表达量在重症脓毒症组较一般脓毒症组高，但未对其在脓毒症中的功能及机制做进一步研究，若后期能对其相关蛋白表达及靶基因深入研究，将为脓毒症治疗开启新天地。

本研究的不足之处:(1)样本量小。受脓毒症患者样本量及死亡病例限制，并没有分析出这几种miRNA 同临床常用指标APACHEⅡ评分，SOFA 评分，CRP 和PCT 之间的关系;(2)临床上绝大多数的脓毒症患者在入ICU 之前已经过大量的药物治疗，因此这几种miRNA 与脓毒症严重程度的相关性尚需要严格控制患者入选条件并大量的样本证实。

［1］Levy M M，Fink M P，Marshall J C，et al.Ramsay G:2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference［J］.Crit Care Med，2003，31(4):1250-1256.

［2］Wang H，Zhang P，Chen W，et al.Evidence for serum miR-15a and miR-16 levels as biomarkers that distinguish sepsis from systemic inflammatory response syndrome in human subjects［J］.Clin Chem Lab Med，2012，50(8):1423-1428.

［3］Wang H，Meng K，Chen W J，et al.Serum miR-574-5p:a prognostic predictor of sepsis patients ［J］.Shock，2012，37(3):263-267.

［4］Bone R C，Balk R A，Cerra F B，et al.Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis.The ACCP/SCCM Consensus Conference Committee.American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine［J］.Chest，1992，101(6):1644-1655.

［5］Ambros V.The functions of animal microRNAs ［J］.Nature，2004，431:350–355.

［6］Vasilescu C，Rossi S，Shimizu M，et al.MicroRNA fingerprints identify miR-150 as a plasma prognostic marker in patients with sepsis［J］.PLoS One，2009，4(10):e7405.

［7］Wang Jiafeng，Yu Manli，Yu Guang，et al.Serum miR-146a and miR-223 as potential new biomarkers for sepsis［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，394(1):184-188.

［8］Wang Huijuan，Zhang Pengjun，Chen Weijun，et al.Serum MicroRNA Signatures Identified by Solexa Sequencing Predict Sepsis Patients'Mortality:A Prospective Observational Study［J］.PLoS One，2012，7(6):e38885.

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［13］Chang J，Nicolas E，Marks D，et al.miR-122，a mammalian liver-specific microRNA，is processed from her mRNA and may downregulate the high affinity cationic amino acid transporter CAT-1［J］.RNA Biol，2004，1(2):106-113.