朱慧丽， 翁泽平， 张继君， 林琛莅， 谢思明， 王 超， 马继伟， 钟雪云△

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，约占所有原发颅内肿瘤的40%［1］。由于脑胶质瘤复发率高，复发后大多恶性度增加，且产生耐药性。一旦复发，再次接受手术的致残、致死率极高，因此化、放疗是复发后治疗的主要手段［2］。耐药性的产生是脑胶质瘤治疗的最重要障碍之一。目前对耐药的研究主要集中在膜转运蛋白和DNA修复蛋白上，但针对其位点的药物开发尚未取得明显进展［3］。前期研究中本实验室从人脑胶质瘤细胞系SWO-38中克隆出SWOZ1和SWOZ2两株亚系［4-5］，同时我们利用敏感细胞株SWOZ2诱导出对卡氮芥［carmustine，1，3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea，BCNU］耐药的细胞系SWOZ2-BCNU［6］。SWOZ2-BCNU 细胞对BCNU 耐药性较SWOZ2细胞高出约5倍，为我们研究人脑胶质瘤获得性耐药提供了理想的细胞模型［7］。

真核翻译起始因子4E结合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1，4EBP1)由118个氨基酸组成，编码基因定位于染色体8p12，对真核翻译起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E)活性的调节发挥重要的作用。4E-BP1主要参与蛋白质合成、细胞生长、增殖和代谢，近年研究发现其与多种肿瘤的恶性度和预后密切相关［8-10］。2009 年 Tam 等［11］报道了4E-BP1参与调节肝癌细胞对化疗药物的敏感性，最近又有学者相继报道了磷酸化4E-BP1作为肿瘤细胞对化疗药敏感的标志物［12-13］，但暂无4E-BP1与胶质瘤耐药的报道。前期研究中我们发现人脑胶质瘤SWOZ2细胞中4E-BP1表达较其获得性耐药细胞株SWOZ2-BCNU明显增加。本文通过RNA干扰实验探讨4EBP1及其磷酸化水平对人脑胶质瘤细胞BCNU耐药性的影响，为寻找克服胶质瘤获得性耐药的新靶点提供理论依据。

材料和方法

1 主要材料和仪器

人脑胶质瘤细胞SWO-38由暨南大学医学院病理学教研室自建，SWOZ2细胞从SWO-38细胞系中通过单克隆形式分离获得，耐药细胞株SWOZ2-BCNU由SWOZ细胞通过BCNU大剂量诱导获得。改良型RPMI-1640购自HyClone，细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)购自 WST，4E-BP1、p-4E-BP1(T37/46)、p-4E-BP1(T70)、p-4E-BP1(S65)和α-tubulin抗体均购自CST，核浆分离试剂盒购自BioVision，加强型化学发光液(ECL)购自Pierce，4EBP1 siRNA由锐博公司设计合成，Lipofectamine 2000脂质体购于Invitrogen，垂直电泳槽及半干式电转移仪器均购自Bio-Rad。

2 方法

2.1 细胞培养 人脑胶质瘤SWOZ2和SWOZ2-BCNU细胞培养于RPMI-1640培养基，其中含10%胎牛血清。将培养瓶置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。

2.2 蛋白提取及Western blotting检测 收集细胞，按照1×1012cells/L加入预冷的RIPA buffer和苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)混合液。取蛋白样本10～20 μg，经5%和10% 十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)2 h(浓缩胶60 V，分离胶100 V)，电转仪350 mA恒流1 h转印至硝酸纤维素膜，经5%BSA室温封闭1 h，Ⅰ抗 4E-BP1、p-4E-BP1(T37/46)、p-4E-BP1(T70)、p-4E-BP1(S65)和 α-tubulin(1∶1 000 稀释)4℃孵育过夜，TBS-T洗膜3次，Ⅱ抗稀释液(稀释比例1∶3 000)室温孵育2 h，ECL底物化学发光试剂盒显影，X胶片曝光、显影、定影，BI2000灰度扫描分析条带。

2.3 siRNA-脂质体混合物的制备及转染 制备过程严格遵守脂质Lipofectamine 2000脂质体说明书要求，优化siRNA和脂质体的用量提高转染效率。最终选用的siRNA浓度为50 nmol/L，稀释siRNA和Lipofectamine 2000转染试剂所选用的培养基均不含血清和抗生素，转染约6 h后更换含有血清不含抗生素的培养基，根据实验要求进行后续实验。

2.4 耐药性检测 将呈对数生长的 SWOZ2和SWOZ2-BCNU细胞以每孔1 000个接种于96孔培养板中，培养24 h后换入药物浓度呈2倍递增的BCNU(2～128 mg/L)，另设不加药物的对照孔以及不加药物和细胞的空白对照，每种药物浓度做4个平行孔。培养72 h后，更换培养基，加入100 μL不含药物的新鲜培养基和10 μL CCK-8试剂，继续培养2 h后在酶标仪上检测波长为450 nm的吸光度(absorbance，A)，用 SPSS 13.0 软件中的 Probit法计算出药物的半数抑制浓度(50%inhibitory concentration，IC50)。

2.5 细胞免疫荧光检测 SWOZ2和SWOZ2-BCNU细胞接种于已放入盖玻片的6孔培养板，24 h贴壁后4%多聚甲醛固定30 min，0.2%Triton X-100室温10～15 min，10%BSA 封闭60 min，加4E-BP1和 p-4E-BP1(T70)Ⅰ抗(1∶200稀释)4℃静置过夜，避光下滴加荧光标记的Ⅱ抗，室温孵育1 h，每孔分别加入适量的DAPI溶液，将盖玻片盖于载玻片上，缓冲甘油封片，避光条件下，用激光共聚焦显微镜观察并拍照。

3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间均数比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 4E-BP1及其磷酸化蛋白在SWOZ2和SWOZ2-BCNU细胞中的表达

获得性耐药细胞株SWOZ2-BCNU中4E-BP1及其磷酸化蛋白 p-4E-BP1(T37/46)、p-4E-BP1(T70)和p-4E-BP1(S65)表达较SWOZ2细胞明显下降(P＜0.05)，但2株细胞中p-4E-BP1(T70)占总蛋白比例的差异无统计学意义(P＞0.05)，见图1。这说明4E-BP1通过表达量的改变参与人脑胶质瘤细胞的获得性耐药。

2 4E-BP1沉默后SWOZ2细胞对BCNU耐药性的变化

Figure 1.Expression of 4E-BP1 and its phosphorylated proteins in SWOZ2 and SWOZ2-BCNU cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs SWOZ2 group.图14E-BP1及其磷酸化蛋白在SWOZ2和SWOZ2-BCNU细胞中的表达水平

小分子RNA干扰4E-BP1基因的有效浓度为50 nmol/L，48 h后Western blotting检测显示4E-BP1及其磷酸化蛋白表达明显下降 (P＜0.05)，见图2A。下调4E-BP1表达后SWOZ2细胞对BCNU的敏感性明显下降 (P＜0.05)，IC50值明显增高 (P＜0.05)，出现了药物抵抗，见图2B、C。

Figure 2.Down-regulation of 4E-BP1 reduced the sensitivity of SWOZ2 cells to BCNU.A:expression of 4E-BP1 and its phosphorylated proteins in SWOZ2 cells with or without 4E-BP1 siRNA transfection was detected by Western blotting;B:viability of SWOZ2 cells with or without 4E-BP1 siRNA transfection treated with different concentrations of BCNU was measured by CCK-8 assay;C:IC50of BCNU for SWOZ2 cells with or without 4E-BP1 siRNA transfection.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group.图2 小干扰RNA下调4E-BP1表达后SWOZ2细胞对BCNU耐药性的改变

3 4E-BP1及其磷酸化蛋白 p-4E-BP1(T70)在SWOZ2和SWOZ2-BCNU细胞中表达位置的差异

激光共聚焦显微镜检测4E-BP1及p-4E-BP1(T70)在SWOZ2和SWOZ2-BCNU细胞中的表达位置发现，总4E-BP1在2株细胞细胞核及细胞浆中呈均匀分布，见图3A。磷酸化4E-BP1(T70)蛋白在SWOZ2细胞核、浆中也呈相对均匀分布，但在SWOZ2-BCNU细胞核中表达较细胞浆中明显增强，见图3B，说明p-4E-BP1(T70)蛋白在BCNU诱导耐药的过程中逐渐出现了核转位。使用核浆分离试剂盒分别检测2株细胞核、浆中4E-BP1和p-4E-BP1(T70)蛋白含量，显示SWOZ2-BCNU细胞核中 p-4E-BP1(T70)蛋白比细胞浆中明显增多(P＜0.05)，见图3C，与激光共聚焦显微镜检测结果相符。这说明在药物诱导的耐药过程中4E-BP1不但出现了表达量的减少，其磷酸化蛋白还出现了核转位。

Figure 3.Subcellular localization of 4E-BP1 and p-4E-BP1(T70)in SWOZ2 and SWOZ2-BCNU cells.A:localization of 4E-BP1 in SWOZ2 and SWOZ2-BCNU cells detected by laser confocal microscopy;B:localization of p-4E-BP1(T70)in SWOZ2 and SWOZ2-BCNU cells detected by laser confocal microscopy;C:expression of 4EBP1 and p-4E-BP1(T70)proteins in the cytosol and nucleus of SWOZ2 and SWOZ2-BCNU cells detected by Western blotting.Mean± SD.n=3.*P ＜0.05 vs SWOZ2 group.图34E-BP1及p-4E-BP1(T70)在SWOZ2和SWOZ2-BCNU细胞中表达位置的差异

讨 论

目前脑胶质瘤主要以外科手术治疗为主，由于脑胶质瘤呈浸润性生长且多处于脑部重要结构，手术常无法彻底切除，因此化疗成为脑胶质瘤治疗中必不可少的辅助治疗方法。既往研究表明，肿瘤耐药性的产生是基于多因素参与的复杂调控网络系统。探究脑胶质瘤耐药的分子调控机制，寻找有效的逆转耐药的靶点，是改善脑胶质瘤患者生存率的关键。

4E-BP1主要通过自身不同的磷酸化状态来调节eIF4E的活性。在大多数细胞中p-4E-BP1(T70)在核浆中均有表达。但最近有研究发现，p-4E-BP1(T70)在子宫内膜腺癌及HeLa细胞核中表达较细胞质中明显增加［14-15］。在本研究中SWOZ2细胞p-4EBP1(T70)蛋白在细胞核浆是相对均匀分布的，但在获得性耐药细胞株中p-4E-BP1(T70)蛋白在细胞核中的表达较细胞质中明显增加，说明磷酸化4E-BP1在获得性耐药过程中出现了向核内转移的现象。虽然我们对p-4E-BP1(T70)蛋白产生核转位的机制仍不清楚，但这种蛋白质定位的差异也间接暗示4EBP1参与了胶质瘤获得性耐药的产生。

4E-BP1不但参与蛋白质合成、细胞生长、增殖和代谢，最新的研究还发现其参与维持纺锤体和基因的稳定性，具有调控线粒体呼吸功能等多重生物学活性［16-17］。也有研究报道4E-BP1表达水平与肿瘤的恶性度相关［18］。本研究结果显示小干扰RNA下调SWOZ2细胞4E-BP1的表达后，细胞出现明显的药物抗性，模拟了获得性耐药细胞的改变。这说明获得性耐药细胞中4E-BP1表达下调不是一个边缘现象，4EBP1可能是脑胶质瘤获得耐药的关键蛋白，改变4EBP1的表达水平可以改变胶质瘤的耐药性。

为验证体外实验，课题组在临床中寻找既有原发肿瘤标本又有复发后组织标本的病例，发现复发后肿瘤组织中4E-BP1表达有明显减少趋势。但由于恶性脑胶质瘤生存期短，复发的组织标本数有限，这部分数据有待增大样本量后再整理发表。

综上所述，4E-BP1在人脑胶质瘤获得性耐药细胞株中表达减少，通过小干扰RNA下调4E-BP1的表达能重复此现象，并且磷酸化4E-BP1在获得性耐药过程中出现了明显的细胞定位改变，说明4E-BP1参与了人脑胶质瘤获得性耐药，其耐药的具体机制值得我们进一步研究。

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