张巍， 赵行宇，李妍，徐俊杰，姜艳霞，吕士杰

核桃楸是具有治疗作用的稀有树木类物种之一，在亚洲和欧洲，其叶、根及种子是治疗癌症的传统药物[1]。胡桃醌(juglone)又名5-羟基-1, 4-萘醌，是一种天然环状醌类，可从胡桃楸的叶及外壳中提取。研究发现胡桃醌在体外具有抗多种肿瘤细胞(包括人结肠癌细胞和人淋巴瘤细胞)的活性[2-3]。本研究对不同浓度胡桃醌在人宫颈癌HeLa细胞系的生长和诱导细胞凋亡中的作用进行观察，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料 胡桃醌、MTT、二甲基亚砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)购自Sigma公司，Caspase-3分光光度法检测试剂盒购自南京凯基公司。

1.2 细胞培养及形态学观察 人宫颈癌HeLa细胞系由本院实验室保存。细胞置于RPMI 1640完全培养基中，在37℃、5%CO2、95%湿度培养箱中培养。细胞单层贴壁生长，每2d更换1次培养基，每周按1:3传代。于倒置显微镜(日本Olympus)下观察不同浓度胡桃醌对HeLa细胞生长速度、细胞形态以及悬浮细胞比例的影响。

1.3 MTT法检测细胞增殖情况 取对数生长期HeLa细胞，培养24h后，去上清，将细胞分成正常对照组及10、20、50、100、200μmol/L浓度实验组。各组均采用DMEM培养基稀释液培养24h，加入20μl MTT(5mg/ml)，37℃继续孵育4h，弃上清，加入150μl DMSO振荡10min，于570nm处测定吸光度(A)值。

1.4 流式细胞仪检测细胞生长周期 取对数生长期HeLa细胞，培养24h后去上清，分别加入10、20、50、100、200μmol/L胡桃醌，采用DMEM培养基稀释液分别培养24h后，与空白对照组一起进行胰酶消化，PBS洗涤细胞2次，15 000r/min离心10min(离心半径10cm)，弃上清，4℃ 70%乙醇沉淀，PI避光染色30min，COUTLER流式细胞仪检测，Listmode 2.0软件分析细胞周期分布。

1.5 细胞Caspase-3活性检测 各组取50μl含100～200μg蛋白的细胞或组织，采用细胞裂解液裂解，取上清加入50μl 2×Reaction Buffer，再加入5μl Caspase-3底物，37℃避光孵育4h。采用酶标仪或分光光度计于405nm或400nm波长处测定其吸光度(A)值。

2 结 果

2.1 不同浓度胡桃醌对HeLa细胞形态学的影响不同浓度胡桃醌对HeLa细胞形态学的影响见图1。对照组细胞紧贴瓶底，生长密集，细胞间连接紧密，呈有规则的多边形，细胞触角较短，圆形细胞少。经10、20、50、100、200μmol/L浓度胡桃醌处理后，细胞附壁疏松，脱壁，形态变圆，且上述改变随浓度增加更明显。

图1 不同浓度胡桃醌对HeLa细胞形态学的影响(×400)Fig.1 Effect of different concentrations of juglone on HeLa cell morphology (×400)

2.2 胡桃醌对HeLa细胞增殖的影响 不同浓度胡桃醌作用于HeLa细胞后，细胞生长受到不同程度抑制，与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，且该抑制作用呈剂量依赖关系，随着药物浓度增加，抑制率升高(图2)。

2.3 不同浓度胡桃醌对HeLa细胞周期的影响 正常生长的HeLa细胞G2/M期比例为7.50%。经10、20、50、100、200μmol/L胡桃醌处理24h后，G2/M期细胞比例分别增加至12.92%、16.23%、23.64%、34.22%、52.64%(图3)。

图2 不同浓度胡桃醌对HeLa细胞增殖的影响Fig.2 Effect of different concentrations of juglone on Hela cell proliferation

图3 不同浓度胡桃醌对HeLa细胞周期的影响Fig.3 Effect of different concentrations of juglone on HeLa cell cycle

2.4 不同浓度胡桃醌对HeLa细胞Capase-3活性的影响 不同浓度胡桃醌作用HeLa细胞24h后，Caspase-3活性显著增加，且存在剂量依赖关系(图4)。

图4 不同浓度胡桃醌对HeLa细胞Caspase-3活性的影响Fig.4 Effect of different concentrations of juglone on the activity of Caspase-3

3 讨 论

Pin1与肿瘤细胞的分化和增殖有关，是肿瘤细胞中高表达的基因之一[4-5]。胡桃醌的抗肿瘤作用在国内外均有报道，Chao等[6]及Paulsen等[7]认为其能与Pin1催化域发生不可逆结合，从而抑制Pin1的活性。

Caspase家族在细胞凋亡过程中起着非常重要的作用，其中Caspase-3为关键的执行分子，在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。正常情况下Caspase-3以酶原(32kD)形式存在于胞质中，在凋亡的早期阶段被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基(17kD)和两个小亚基(12kD)组成，裂解相应的胞质胞核底物，最终导致细胞凋亡。在细胞凋亡晚期及死亡细胞中，Caspase-3活性明显下降[8-11]。

本研究形态学观察发现，不同浓度的胡桃醌均能使HeLa细胞形态发生变化，且MTT检测显示，不同浓度的胡桃醌均可明显抑制HeLa细胞的增殖。进一步对其凋亡情况进行检测，结果显示不同浓度胡桃醌均可将HeLa细胞周期阻滞于G2/M期，而Caspase-3活性检测显示胡桃醌可使Caspase-3活性增加，且具有剂量依赖性。

总之，本研究结果显示，胡桃醌能诱导宫颈癌细胞凋亡，有望成为继传统化疗药物之后的又一新型化疗药物，为抗肿瘤治疗提供新的途径。

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